Über die Auswirkungen einer HIV-Infektion und Integrasehemmer hinaus

Aug 24, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14327 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das orale Mikrobiom ist nach dem Darm die zweitgrößte mikrobielle Gemeinschaft beim Menschen. Eine Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) löst eine Beeinträchtigung des Immunsystems aus, die das Wachstum und die Ansiedlung von Krankheitserregern in der Mundhöhle begünstigen könnte. Diese Dysbiose wurde mit oralen Manifestationen in Verbindung gebracht, die die Lebensqualität dieser Patienten verschlechtern. Eine antiretrovirale Therapie (ART) könnte auch Veränderungen in bestimmten oralen Bakteriengruppen hervorrufen, die mit solchen parodontalen Erkrankungen verbunden sind. Integrase-Strangtransfer-Inhibitoren (INSTIs), die Therapie der Wahl bei der Behandlung naiver HIV-Patienten, sind in der Lage, die Auswirkungen einer HIV-Infektion auf systemische Entzündungen, Darmpermeabilität und Darmbakterienvielfalt/-reichtum umzukehren. Das Ziel dieser Studie bestand darin, die Auswirkungen einer HIV-Infektion an sich und von INSTIs auf die Zusammensetzung des Speichelbakterioms zu analysieren und dabei andere Faktoren wie Rauchen zu berücksichtigen, die ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf das orale Mikrobiom haben könnten. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden 26 nicht HIV-infizierte Freiwillige und 30 HIV-infizierte Patienten (15 naive und 15 unter INSTIs-Regime) rekrutiert. Zur Messung des Lysozymspiegels wurden Speichelproben entnommen. Die Zusammensetzung des oralen Bakterioms wurde mittels 16S-rRNA-Gensequenzierung analysiert. Naive HIV-infizierte Patienten zeigten statistisch höhere Lysozymspiegel im Vergleich zu Kontrollpersonen (p < 0,001) und mit INSTIs behandelten Patienten (p < 0,05). Unsere Studie konnte keine Unterschiede in der α- oder β-Diversität zwischen den drei analysierten Gruppen feststellen, obwohl signifikante Unterschiede in der Häufigkeit einiger taxonomischer Ordnungen der Bakterien festgestellt wurden (höhere Häufigkeit im Stamm Pseudomonadota, in der Ordnung Acholeplasmatales und in der Gattung Ezakiella). und Acholeplasma in der naiven Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen; und höhere Häufigkeit im Stamm Mycoplasmatota, in der Ordnung Acholeplasmatales und in den Gattungen Acholeplasma und unkultiviertem Eubacteriaceae-Bakterium bei den mit INTIs behandelten HIV-infizierten Patienten im Vergleich zu den Kontrollen). Diese Unterschiede scheinen teilweise unabhängig von der Rauchgewohnheit zu sein. Die Auswirkungen einer HIV-Infektion und von INSTI auf die orale Mikrobiota scheinen nicht sehr stark zu sein, was wahrscheinlich auf die Modulation anderer Faktoren wie Rauchen und die größte Exposition der Mundhöhle nach außen zurückzuführen ist.

Eine HIV-Infektion führt zu einer Beeinträchtigung des Immunsystems, was das Wachstum und die Ansiedlung von Krankheitserregern in der Mundhöhle begünstigen kann. Tatsächlich wurde diese Dysbiose mit oralen Manifestationen wie oropharyngealer Candidiasis in Verbindung gebracht1,2,3. Darüber hinaus kann die antiretrovirale Behandlung (ART) selbst die orale mikrobielle Translokation aufgrund der Hemmung der Reparatur und Proliferation von Epithelzellen erhöhen4, 5. HIV und ART führen zu Veränderungen in spezifischen Bakterientaxa im oralen Mikrobiom, die mit Parodontalerkrankungen verbunden sind6. Tatsächlich wurde kürzlich berichtet, dass Veränderungen im oralen Mikrobiom nach Beginn der ART komplex sind und möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Immunfunktion und bei entzündlichen Erkrankungen spielen6. Die Analyse der oralen Mikrobiota anhand von supra- und subgingivalen Plaqueproben ist oft zeitaufwändig7, 8. Aus diesem Grund hat die speichelbasierte Analyse große Aufmerksamkeit erlangt, da sie einfach, nicht-invasiv und kostengünstig ist9,10,11.

Frühere Arbeiten unserer Gruppe zeigten, dass auf Integrase-Strangtransfer-Inhibitoren (INSTIs) basierende ARTs mit einem Ausmaß an systemischer Entzündung, bakterieller Translokation und mikrobieller Diversität verbunden waren, die denen ähnelten, die bei nicht infizierten Kontrollpersonen beobachtet wurden12. Darüber hinaus zeigten diese Studien einen deutlichen Einfluss von HIV-Infektionen und INSTI-basierten Behandlungen auf das Darmbakteriom13 und das Virom14. Allerdings bedarf es weiterer Forschung, wie langfristige ART und insbesondere INSTIs die orale Mikrobiota bei HIV-infizierten Patienten modulieren und welche Auswirkungen diese Auswirkungen auf die Gesundheit haben. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Auswirkungen einer HIV-Infektion und INSTI-basierter Therapien in der Erstbehandlung auf die Zusammensetzung des Speichelbakterioms zu analysieren. Da außerdem einige Gewohnheiten wie das Rauchen die orale Mikrobiota verändern können15, untersuchten wir auch die Auswirkungen des Rauchens auf die Zusammensetzung der oralen Mikrobiota von HIV-infizierten Patienten mit und ohne INSTI-basierte Behandlungen.

HIV-infizierte Patienten (naiv und unter ART) sowie nicht infizierte Freiwillige, die als „gesunde“ Kontrollen verwendet wurden, wurden aus der Abteilung für Infektionskrankheiten am Hospital Universitario San Pedro (HUSP) und aus dem Gesundheitszentrum „Siete Infantes de Lara“ rekrutiert ” (Logroño, Spanien) von März 2019 bis Februar 2021, wie zuvor beschrieben13, 14. Ergänzende Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der Patientenrekrutierung, und die Merkmale dieser Gruppen können in Referenzen eingesehen werden13, 14.

Bei CIBIR wurden frische Speichelproben entgegengenommen, in Röhrchen (ca. 500 μl) aliquotiert und zur weiteren Analyse bei –80 ° C gelagert. Nach dem Auftauen wurde die Lysozymkonzentration im Speichel durch einen Enzymimmunoassay (ELISA) von ABCAM (Ab108880) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Der Intra-Assay- und der Inter-Assay-Variationskoeffizient (CV), ausgedrückt als Prozentsatz, betragen 4,7 % bzw. 9,5 %.

Nach dem Auftauen wurde die DNA mit einer modifizierten Version des DNeasy® Blood and Tissue Kits (Qiagen, Venlo, Niederlande) extrahiert. Bei diesem Protokoll werden 250 µl Speichel in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Dann wird 1 ml PBS zugegeben und die Mischung 5 Minuten lang bei 1800 g zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und das Pellet in 180 µl PBS resuspendiert und in ein anderes Eppendorf-Röhrchen überführt. Als nächstes werden 25 µl Proteinase K und 200 µl Puffer AL hinzugefügt, gefolgt von 20-sekündigem Vortexen und Zentrifugieren. Die Mischung wird 10 Minuten lang bei 56 °C inkubiert. Danach werden 200 µl Ethanol zugegeben, 20 s lang gevortext und zentrifugiert. Die resultierende Lösung wird auf eine Säule übertragen und 1 Minute lang bei 6000 g zentrifugiert und das gesammelte Röhrchen mit dem Filtrat wird verworfen. Die Säule wird dann in ein neues Sammelröhrchen gegeben, 500 µl Puffer AW1 werden hinzugefügt und zentrifugiert, und das gesammelte Röhrchen mit dem Filtrat wird verworfen. Anschließend wird die Säule erneut in ein neues Sammelröhrchen gestellt, 500 µl Puffer AW2 hinzugefügt und 3 Minuten lang bei 20.000 g zentrifugiert. Das gesammelte Röhrchen mit dem Filtrat wird verworfen. Abschließend wird die Säule in ein neues Eppendorf-Röhrchen gestellt, 50 µl Puffer AE hinzugefügt und 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Mischung 1 Minute lang bei 6000 g zentrifugiert und der Elutionsvorgang wiederholt. Nach diesem Prozess wurden Reinheit, Konzentration und Qualität mit einem Qubit 3.0-Fluorometer (Kit dsDNA HS, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) und einem Fragmentanalysator (HS Genomic DNA 50 Kb Kit, Agilent, USA) bestimmt. Anschließend wurden die Proben für die hypervariablen 16S-rRNA-Regionen V3–V416 amplifiziert und die Sequenzierung mit einem Illumina-Sequenzer (MiSeq, 2 × 300 pb, gepaartes Ende) in der Genomics & Bioinformatics Core Facility am CIBIR durchgeführt.

Der erste Schritt bei der Computeranalyse bestand darin, die Qualität der Lesevorgänge mit dem Qualitätskontrolltool FastQC-Programm17 zu überprüfen. Anschließend wurde die Qiime2-Pipeline18 entlang der bioinformatischen Analyse verwendet. Zunächst wurden die vom Illumina-Sequenzer bereits demultiplexten Rohsequenzen (Zuordnung der Barcodes zu den Proben, zu denen sie gehören) mit der DADA2-Software19 entrauscht. Insbesondere wurden das Trimmen von Sequenzierungsadaptern und Primerregionen, das Filtern von verrauschten Lesevorgängen, das Dereplizieren unserer Sequenzen zur Reduzierung von Wiederholungen, das Zusammenfügen gepaarter Lesevorgänge, die Identifizierung von Amplikonsequenzvarianten (ASVs) und die Eliminierung von Chimären durchgeführt . Zweitens verwendeten wir die SILVA-Datenbank20, die während des Nasslaborprozesses mit den V3-V4-Amplifikationsprimern trainiert wurde, um die taxonomische Zuordnung vorzunehmen. Die Alpha- und Beta-Diversität wurde analysiert: Die α-Diversität ist ein Maß für den Artenreichtum auf Probenebene, während die β-Diversität die Ähnlichkeit der mikrobiellen Zusammensetzung zwischen Subjekten beschreibt und die Identifizierung großer Unterschiede zwischen Proben erleichtert. Das Maß der α-Diversität wurde mithilfe der beobachteten Merkmale, des Chao1-Index, des Fisher-Alpha, des Pielou-Index, des Shannon-Index und des Simpson-Index analysiert und die Unterschiede zwischen den Gruppen mithilfe des Kruskal-Wallis-Tests bewertet. Beobachtete Merkmale, der Chao1-Index und das Fisher-Alpha basieren auf der Reichhaltigkeit, der Pielou-Index basiert auf der Gleichmäßigkeit und der Shannon-Index und der Simpson-Index basieren auf der Diversität (Reichtum + Gleichmäßigkeit). Das Maß der β-Diversität wurde mit PERMANOVA (999 Permutationen) auf der Bray-Curtis-Metrik analysiert und mit der Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) von R-Software (Version 4.0.5) und R Studio (Version 1.4.1105) visualisiert. Schließlich wurde die Analyse der unterschiedlichen Zusammensetzung von Bakterien mit der ANCOM-Methodik auf taxonomischer Ebene der Stämme, Ordnungen und Gattungen durchgeführt. Diese Methode berücksichtigt die zugrunde liegende Struktur der Daten und wird häufig zum Vergleich der Zusammensetzung von Mikrobiomen in zwei oder mehr Populationen verwendet, ohne Annahmen über die Populationsverteilung21. ANCOM führt lediglich eine Reihe paarweiser Tests für die folgende Unterhypothese durch:

wobei \({x}_{i}\) die i-te ASV-Häufigkeit aus Stichprobe x bezeichnet, \({x}_{j}\) die j-te ASV-Häufigkeit aus Stichprobe x bezeichnet, \({y}_{i} \) bezeichnet die i-te ASV-Häufigkeit aus Probe y und \({y}_{j}\) bezeichnet die j-te ASV-Häufigkeit aus Probe y. Der W-Wert ist lediglich eine Zählung, wie oft \({H}_{0(ij)}\) für den i-ten ASV abgelehnt wird.

Merkmale der Population und Lysozymspiegel werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mannes (SEM) dargestellt. Kategoriale Variablen wurden mit dem Chi-Quadrat-Test oder dem exakten Fisher-Test analysiert. Die Normalverteilung quantitativer Variablen wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test überprüft. Der Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde je nach Normalität der Daten mithilfe des ungepaarten t-Tests oder des Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt. Der Vergleich zwischen drei oder mehr Gruppen wurde unabhängig von der Normalität der Daten mithilfe der ANOVA und anschließend post-hoc mit Tukey analysiert. p-Werte < 0,05 und Falscherkennungsraten (FDRs) < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die statistische Analyse wurde mit R-Software (Version 4.0.5) und R Studio (Version 1.4.1105) durchgeführt.

Diese Studie wurde im Einklang mit der Helsinki-Erklärung durchgeführt und vom Komitee für Ethik in der Arzneimittelforschung in La Rioja (CEImLAR) genehmigt (28. Februar 2019, Referenznummer 349). Alle Teilnehmer gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung ab.

Die Hauptmerkmale der rekrutierten Bevölkerung (Ergänzungstabelle 1 und Ergänzungstabelle 2) wurden zuvor beschrieben13, 14. Bemerkenswert ist, dass die Rauchgewohnheiten in der naiven Gruppe und der mit INSTIs behandelten Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen höher waren (11,54 vs. 46,67 % und 66,67 %). , jeweils). Andererseits berichtete keine der rekrutierten Personen über parodontale Erkrankungen. Schließlich berichtete keiner der Patienten über unterschiedliche Ernährungsgewohnheiten.

Bei naiven HIV-infizierten Patienten wurde ein statistisch signifikanter Anstieg der Lysozymkonzentrationen im Speichel im Vergleich zur Kontrollpopulation (p < 0,001) und auch im Vergleich zu mit INSTIs behandelten Patienten (p < 0,05) beobachtet (Abb. 1). Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der mit INSTIs behandelten Gruppe festgestellt (Abb. 1).

Lysozymspiegel in der untersuchten Population im Vergleich zur Kontrollgruppe, der naiven Gruppe und der mit INSTIs behandelten Gruppe. ***p < 0,001 im Vergleich zur Kontrolle und #p < 0,05 im Vergleich zu INSTIs. INSTIs integrieren eine auf Integrase-Strangtransfer-Inhibitoren basierende Behandlung.

Nach der DNA-Extraktion hatten alle Proben eine DNA-Konzentration zwischen 11,40 und 336,00 ng/μl mit einem Mittelwert von 86,77 ng/μl und einem Median von 73,70 ng/μl. Insgesamt wurden jeweils 12,5 ng für die Amplifikations-PCR verwendet, den ersten Schritt des Bibliotheksvorbereitungsprotokolls. Darüber hinaus wurden bei der Berücksichtigung der DNA-Qualität, gemessen als DNA-Integrität durch den GQN-Parameter im FA-System, alle Proben mit Werten zwischen 0,6 und 3,6 bewertet. In Proben, in denen ein spezifisches Fragment von 450–500 bp amplifiziert wurde, ist die Beurteilung der genomischen Integrität möglicherweise nicht so aussagekräftig, da der Schwerpunkt eher auf der Amplifikation einer bestimmten Zielregion als auf der Gesamtintegrität des Genoms liegt. Als Zwischenschritt nach der Amplikon-PCR, aber vor dem Indexierungsschritt wurde das Vorhandensein des Amplikons mit dem Fragment Analyzer (Amplicon Library Kit, 35–5000 bp, AATI) überprüft, was zu Fragmenten mit einer Größe von 500 bis 540 bp führte . Dieser Schritt bestätigte die erfolgreiche Amplifikation der Zielregion und stellte das Vorhandensein des gewünschten Amplifikats für die weitere Analyse oder Sequenzierung sicher. Nach der Bibliotheksvorbereitung wurden alle endgültigen Bibliotheken erneut mithilfe der Qubit-Fluorometrie quantifiziert und mithilfe des Fragmentanalysators (Amplicon Library Kit, 35–5000 bp, AATI) qualifiziert, um die durchschnittliche Amplikongröße zu bestimmen. Diese Informationen (Konzentration und mittlere Bibliotheksgröße) ermöglichten es uns, die Bibliotheken anschließend auf die gleiche Konzentration (nM) zu normalisieren, um einen äquimolaren Pool bei 10 pM herzustellen. In diesem Fall wiesen die Bibliotheken eine Konzentration im Bereich von 31 bis 210 ng/µL auf, mit einem Mittelwert von 94,80 ng/µL, bestimmt durch Fluorometrie. Darüber hinaus lag die durchschnittliche Amplikongröße zwischen 600 und 630 bp, wobei berücksichtigt wurde, dass diese Größe 120 bp umfasst, die den Sequenzierungsadaptern entsprechen, die in der Bibliotheksvorbereitung für das V3-V4-Amplikon durch PCR enthalten waren. Die individuelle durchschnittliche Amplikongröße mit der Bibliothekskonzentration (ng/ul) wurde zur Berechnung der Molarität jeder Probe verwendet, normalisiert auf 10 nM und eines endgültigen äquimolaren Pools bei 10 pM, der in den MiSeq-Sequenzer eingeführt wurde.

Die in dieser Studie aus den Speichelproben gewonnenen rohen Sequenzierungsablesungen lagen zwischen einem Minimum von 134.247 und einem Maximum von 396.314 Reads. Nach dem Trimmen des Adapters, dem Entfernen von Regionen mit geringer Qualität und der Verarbeitung mithilfe des DADA2-Protokolls wurden insgesamt zwischen 66.634 und 187.188 Lesevorgänge aufrechterhalten (entsprechend einem prozentualen Bereich relativ zu den anfänglichen 38,33–50,34 % der anfänglichen Lesevorgänge).

Es wurden keine statistischen Unterschiede hinsichtlich der α-Diversität des oralen Bakterioms beobachtet (beobachtete Merkmale, Chao1-Index, Fisher-Alpha, Pielou-Gleichmäßigkeit, Simpson-Index und Shannon-Index) (ergänzende Abbildung 2).

Die Analyse der β-Diversität ergab auch kein unterschiedliches Clustermuster zwischen den drei analysierten Gruppen (ergänzende Abbildung 3).

Bezüglich der Zusammensetzung und/oder Häufigkeit der oralen Mikrobiota wurden insgesamt 20 Phyla und 68 Ordnungen nachgewiesen. Die drei im Speichel am häufigsten vorkommenden Phyla waren Bacteroidota (12,61–64,16 %), Bacillota (7,37–66,14 %) und Pseudomonadota (0,12–54,40 %). Auf der Ordnungsebene waren Bacteroidales (10,05–63,13 %), Lactobacillales (2,65–56,11 %) und Betaproteobacteriales (0,04–42,54 %) am häufigsten.

Beim Vergleich von Kontrollen mit naiven Patienten wurde eine signifikant höhere Häufigkeit im Stamm Pseudomonadota, in der Ordnung Acholeplasmatales (Stamm Bacillota) und in den Gattungen Ezakiella (Ordnung Tissierellia, Stamm Bacillota) und Acholeplasma (Ordnung Acholeplasmatales, Stamm Bacillota) beobachtet naive Gruppe im Vergleich zu Kontrollen (Tabelle 1). Andererseits wurde beim Vergleich von Kontrollen mit mit INSTIs behandelten HIV-infizierten Patienten eine höhere Häufigkeit im Stamm Mycoplasmatota, in der Ordnung Acholeplasmatales (Stamm Bacillota) und in den Gattungen Acholeplasma (Ordnung Acholeplasmatales, Stamm Bacillota) und unkultivierten Eubacteriaceae festgestellt Bei den mit INSTIs behandelten HIV-infizierten Patienten wurden Bakterien (Ordnung Eubakteries, Stamm Bacillota) nachgewiesen (Tabelle 1). Es wurden keine Unterschiede zwischen beiden HIV-infizierten Gruppen beobachtet. Bei HIV-infizierten Patienten wurden keine geringeren Häufigkeiten beobachtet.

Da Rauchen einen Einfluss auf die orale Mikrobiota hat22, haben wir untersucht, ob Rauchgewohnheiten die durch eine HIV-Infektion per se und/oder INSTIs ausgelösten Wirkungen modulieren können. Wir haben herausgefunden, dass orale Mikrobiota von rauchenden Personen (unabhängig von ihrem HIV-Status) einen statistisch signifikanten Anstieg aller analysierten α-Diversitätsindizes zeigten (p < 0,01 für beobachtete Merkmale, Chao1-Index und Fisher's Alpha und p < 0,05 Pielou's Evenness, Shannon). Index und Simpson-Index) im Vergleich zu Nichtrauchern (ergänzende Abbildung 4). Darüber hinaus ergab die Analyse der β-Diversität eine unterschiedliche Häufung zwischen den beiden Gruppen (p <0, 001) (ergänzende Abbildung 5), was auf eine klare Auswirkung von Tabak auf die Zusammensetzung/Gemeinschaft der oralen Mikrobiota schließen lässt.

Wenn nur HIV-infizierte Patienten nach ihren Rauchgewohnheiten (und unabhängig davon ART) in zwei Gruppen aufgeteilt wurden, zeigten die Proben von rauchenden Personen einen statistisch signifikanten Anstieg der analysierten Reichhaltigkeitsindizes (p < 0,05 für beobachtete Merkmale, Chao1-Index, und Fisher-Alpha) (Abb. 2) im Vergleich zur nicht rauchenden HIV-infizierten Bevölkerung. Darüber hinaus ergab die Analyse der β-Diversität eine unterschiedliche Clusterbildung zwischen den beiden Gruppen (p <0,05) (Abb. 3).

Verschiedene Indizes der α-Diversität von Bakterien in Speichelproben von HIV-infizierten Patienten im Hinblick auf das Rauchverhalten. *p < 0,05 im Vergleich zu Nichtrauchern.

PCoAs von Bakterien in Speichelproben von HIV-infizierten Patienten hinsichtlich der Rauchgewohnheiten (30 % der Gesamtvariation [Komponente 1 = 18 % und Komponente 2 = 12 %]). Die Ergebnisse werden gemäß den ersten beiden Hauptkomponenten dargestellt. Jeder Kreis stellt eine Stichprobe dar: Rote Kreise stehen für Nichtraucher und blaue Kreise für Raucher. Die Häufung der Stichproben wird durch ihre jeweilige Ellipse des 95 %-Konfidenzintervalls dargestellt. *p < 0,05 Raucher versus Nichtraucher.

In Anbetracht der eindeutigen Auswirkungen des Rauchens auf die orale Mikrobiota analysierten wir als nächstes die Kontrollpersonen, naive HIV-infizierte Patienten und mit INSTIs behandelte Patienten unter Berücksichtigung ihres Raucherstatus und verglichen erstens die Nichtraucher und zweitens die Raucher.

Es wurden keine Unterschiede in der α-Diversität der Nichtraucherpopulation festgestellt (ergänzende Abbildung 6). Darüber hinaus ergab die Analyse der β-Diversität auch keine unterschiedliche Häufung zwischen den drei Gruppen (ergänzende Abbildung 7). Die Analyse der unterschiedlichen Häufigkeit ergab jedoch, dass einige taxonomische Ordnungen zwischen den Gruppen unterschiedlich vertreten waren, obwohl das Ausmaß dieser Unterschiede nicht sehr stark war. Insbesondere zeigte die mit INSTIs behandelte Gruppe eine höhere Häufigkeit von Phylum Mycoplasmatota (W = 1) und eine geringere Häufigkeit von Phyla Epsilonbacteraeota (W = 4), Bacteroidota (W = 1), Spirochaetota (W = 1) und Cemmatimonadetes (W =). 1), Chlamydiota (W = 1), Acidobacteriota (W = 1) und Campylobacterota (W = 1) und der Ordnung Campylobacterales (W = 10) im Vergleich zu Kontrollen. Andererseits wurde in der mit INSTIs behandelten Gruppe im Vergleich zur naiven Gruppe eine höhere Häufigkeit der Phyla Epsilonbacteraeota (W = 2) und Bacteroidota (W = 1) beobachtet.

Andererseits wurden weder in der α-Diversität noch in der β-Diversität oder der unterschiedlichen Häufigkeit signifikante Unterschiede beobachtet, wenn nur Raucher analysiert wurden (ergänzende Abbildungen 8 und 9).

Im Gegensatz zu den Ergebnissen unserer früheren Arbeiten zur Darmmikrobiota13, 14 scheinen die Auswirkungen von HIV-Infektionen und INSTIs auf die orale Mikrobiota nicht sehr signifikant zu sein, was wahrscheinlich auf die Modulation anderer Faktoren wie Rauchen und die größte äußere Exposition zurückzuführen ist der Mundhöhle.

Lysozym ist ein antimikrobielles Protein, das von verschiedenen Zellen exprimiert wird, darunter Neutrophilen, Makrophagen und Epithelzellen. Es kommt reichlich im Speichel vor und spielt eine wichtige Rolle im konstitutiven Abwehrsystem des Wirts23. Frühere Studien haben einen Anstieg der Lysozymspiegel im Speichel bei immungeschwächten Patienten gezeigt24, 25, der als Kompensationsmechanismus dienen könnte, um den Rückgang der Anzahl der CD4-T-Lymphozyten zu mildern. Außerdem wurde festgestellt, dass Lysozym aus Hühnereiweiß, menschlicher Milch und menschlichen Neutrophilen in vitro eine antivirale Aktivität gegen HIV-Infektionen besitzt26. Da sich unsere Studie auf orale Mikrobiota konzentrierte, hielten wir es für interessant, diesen Marker als indirektes Maß für die HIV-Infektion und insbesondere für die Mechanismen zu quantifizieren, die in Gang gesetzt werden, um der Infektionswirkung und dem möglichen Zusammenhang mit oraler Infektion entgegenzuwirken Mikrobiota. Tatsächlich beobachteten wir einen statistisch signifikanten Anstieg der Speichel-Lysozym-Konzentration bei naiven HIV-infizierten Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen und INSTIs, parallel zu der bei diesen Patienten beobachteten Abnahme der CD4-T-Lymphozyten, was auf einen möglichen Zusammenhang zwischen Lysozym, Infektion und immunologischer Reaktion schließen lässt . Interessanterweise zeigten mit INSTI behandelte Patienten einen signifikanten Rückgang des Speichelspiegels dieses Enzyms bei gleichzeitigem Anstieg der CD4-T-Lymphozyten. Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die die Auswirkungen von INSTIs auf die Lysozymkonzentrationen im Speichel untersuchte. Unsere Ergebnisse könnten die potenzielle Verwendung dieses Enzyms als nicht-invasiven Biomarker für die nach INSTIs beobachtete immunologische Erholung verdeutlichen, diesbezüglich sind jedoch weitere Studien erforderlich.

Unsere Studie konnte keine Unterschiede in der α- oder β-Diversität im Zusammenhang mit einer HIV-Infektion und/oder einer INSTI-basierten Behandlung feststellen. Ebenso konnten Presti et al.6 keine Unterschiede in der α- oder β-Diversität zwischen der naiven Gruppe und der ART-behandelten Gruppe (behandelt mit EFV/FTC/Tenofovir(TDF)) feststellen. Auch Imahashi et al.27 zeigten keine Unterschiede im Artenreichtum zwischen HIV-negativen Menschen und ART-behandelten HIV-infizierten Personen. Li et al.28 zeigten jedoch einen statistisch signifikanten Rückgang des Chao1-Index und des Shannon-Index zwischen der naiven Gruppe und der Kontrollgruppe sowie eine unterschiedliche Häufung zwischen beiden Gruppen. Die Unterschiede könnten durch die Tatsache erklärt werden, dass die Populationen zwischen den Studien unterschiedlich waren. Tatsächlich wurden in der Studie von Li et al.28 nur HIV-infizierte MSM-Patienten aus Peking eingeschlossen, während in unserer Studie der Anteil der MSM in der naiven Gruppe 60,00 % und in der ART-behandelten Gruppe nur 46,67 % betrug. Darüber hinaus waren nur 15 HIV-infizierte Patienten in unserer Studie keine Kaukasier (keiner davon aus Asien). Daher muss der potenzielle Einfluss der Herkunft der Probanden (im Sinne von „Ernährungsgewohnheiten“) und/oder der sexuellen Orientierung und Übertragungsart der HIV-Infektion auf die Zusammensetzung der oralen Mikrobiota weiter untersucht werden. Darüber hinaus unterschieden sich auch die hypervariablen Regionen des analysierten 16S-rRNA-Gens in beiden Studien (V4-V5 vs. V3-V4 in unserer Studie).

In unserer Studie waren die drei am häufigsten vorkommenden Phyla Bacteroidetes (heute bekannt als Bacteroidota), Firmicutes (heute bekannt als Bacillota) und Pseudomonadota, was mit den Ergebnissen von Li et al.28 und Presti et al.6 korreliert. Wir beobachteten, dass einige Taxa in der naiven Gruppe und in der mit INSTIs behandelten Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen zunahmen. Erwähnenswert ist der beobachtete Anstieg der Gattung Acholeplasma bei HIV-infizierten Patienten unabhängig von ART. Es wurde nachgewiesen, dass Acholeplasmalaylawii durch die Bindung an seine Glykoglycerolipide das Eindringen einer HIV-Infektion in Zellen erleichtern kann29 und eine Behandlung ist nicht in der Lage, seine Präsenz zu reduzieren. Die klinischen Auswirkungen (systemisch und lokal) dieser höheren Häufigkeiten sollten eingehend untersucht werden.

Wir beobachteten auch, dass Rauchen die Diversität und Zusammensetzung der Speichelbakteriomen in der Allgemeinbevölkerung beeinflusst, wie bereits von Gopinath et al.15 festgestellt wurde. Trotz dieser Tatsache beobachteten wir jedoch auch, dass die Auswirkungen von HIV-Infektionen und INSTIs auf die orale Mikrobiota teilweise unabhängig vom Rauchen waren, da weder bei der α-Diversität noch bei der β-Diversität sowohl bei Rauchern als auch bei Nichtrauchern, die getrennt analysiert wurden, Auswirkungen beobachtet wurden. Bemerkenswert ist, dass in der Häufigkeit einiger taxonomischer Ordnungen von Bakterien in der Nichtraucherpopulation einige Unterschiede (statistisch gesehen nicht sehr aussagekräftig) in der Nichtraucherpopulation festgestellt wurden, während bei den Rauchern keine Veränderungen beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass Rauchen die Wirkung modulieren oder sogar „puffern“ könnte. „maskieren“ die Auswirkungen von HIV und INSTIs auf die orale Mikrobiota. Darüber hinaus könnten die weniger starken Auswirkungen auf die orale Mikrobiota durch die Tatsache erklärt werden, dass die Mundhöhle eine höhere interindividuelle Variabilität aufweist, da sie stärker der Umwelt/Ernährung ausgesetzt ist. Außerdem lösen sich ART-Pillen nicht im Speichel auf, sodass sie eher eine systemische als eine lokale Wirkung in der Mundhöhle haben.

Diese Studie weist einige Einschränkungen auf. Einige der Patienten wurden während der COVID-19-Pandemie rekrutiert. Allerdings meldete keiner von ihnen vor der Probenentnahme Symptome im Zusammenhang mit COVID-19 und sie wurden im Vormonat nicht geimpft. Außerdem ist die Anzahl der Patienten in jeder Gruppe gering (was die Wahrscheinlichkeit eines Typ-II-Fehlers erhöht), aber groß genug, um Unterschiede zwischen den Gruppen festzustellen. Darüber hinaus wurden einige Unterschiede zwischen den Kontrollgruppen und HIV-infizierten Gruppen festgestellt, wie etwa Geschlecht, Alter und Rauchgewohnheiten, allesamt Faktoren, die einen Einfluss auf die Zusammensetzung der Mikrobiota haben könnten. Allerdings waren die beiden HIV-infizierten Gruppen hinsichtlich dieser Faktoren ausgeglichen. Darüber hinaus erfasst die Speichelprobenahme zwar praktisch und nicht-invasiv, erfasst jedoch möglicherweise nicht die gesamte Vielfalt anaerober Bakterien im Mund, sodass nicht ausgeschlossen werden kann, dass andere Methoden zu anderen Ergebnissen führen. Schließlich führten die Patienten eine Umfrage durch, die sich auf Ernährungsgewohnheiten/-muster konzentrierte, um Gewohnheiten zu ermitteln, die sich auf die Mikrobiota auswirken könnten, wie z. B. Veganismus oder übermäßiger Konsum von Präbiotika und/oder Probiotika. Keiner der Patienten berichtete über solche unterschiedlichen Gewohnheiten.

Die Lysozymkonzentration ist bei unbehandelten Patienten im Vergleich zur Kontrollpopulation erhöht, was auf einen Kompensationsmechanismus hindeutet, der den Rückgang der Anzahl der CD4-T-Lymphozyten mildert. Tatsächlich erhöhte die INSTI-Behandlung die CD4-T-Zellen bei den Patienten und verringerte gleichzeitig die Lysozymspiegel, was den Zusammenhang zwischen Lysozym-Immunreaktion und Infektion bestätigt. Andererseits war der Einfluss der HIV-Infektion und der INSTIs auf die orale Mikrobiota nicht sehr stark, was wahrscheinlich auf die Modulation anderer Faktoren wie Rauchen und der größten Exposition der Mundhöhle nach außen zurückzuführen ist. Tatsächlich erhöht Rauchen die Bakterienvielfalt im Speichel und beeinflusst auch die Zusammensetzung der Bakterien. Daher könnte Rauchen die Auswirkungen von HIV und INSTIs auf die orale Mikrobiota modulieren oder sogar „puffern/maskieren“, und dies könnte der Grund für die beobachteten milden Auswirkungen auf das Speichelmikrobiom sein.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im NCBI SRA-Repository unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/819232 verfügbar und auf begründete Anfrage auch beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir möchten allen Teilnehmern dieser Studie und den an der Patientenrekrutierung beteiligten Ärzten danken.

Diese Arbeit wurde von der Rioja Health Foundation unterstützt und PVB erhielt ein Doktorandenstipendium vom Rat für wirtschaftliche Entwicklung und Innovation (Regierung von Rioja).

Abteilung für Infektionskrankheiten, Mikrobiota und Stoffwechsel, Abteilung für Infektionskrankheiten, Zentrum für biomedizinische Forschung von La Rioja (CIBIR), C/Piqueras 98, CIBIR-Gebäude, dritte Etage, 26006, Logroño, La Rioja, Spanien

Pablo Villoslada-Blanco, Patricia Pérez-Matute, Emma Recio-Fernández, María Íñiguez und José A. Oteo

Gesundheitszentrum Siete Infantes de Lara, Logroño, La Rioja, Spanien

Pilar Blanco-Navarrete

Abteilung für Infektionskrankheiten, Hospital Universitario San Pedro, Logroño, La Rioja, Spanien

Luis Metola, Valvanera Ibarra, Jorge Alba und Jose A. Oteo

Plattform für Genomik und Bioinformatik, Zentrum für biomedizinische Forschung von La Rioja (CIBIR), Logroño, La Rioja, Spanien

Maria de Toro

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PPM und JAO konzipierten das Studienkonzept. PBN, LM, VI, JA und JAO rekrutierten die Patienten. PVB, MI und ER führten die Verfolgung der Proben und die DNA-Extraktion aus dem Speichel durch. Die Notaufnahme führte die ELISAs durch, um den Lysozymspiegel im Speichel zu messen. PVB und MT führten die 16S-rRNA-Gensequenzierung und die bioinformatische Analyse durch. PVB und PPM führten die statistische Analyse durch. PVB, PPM und JAO haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Patricia Pérez-Matute.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Villoslada-Blanco, P., Perez-Matute, P., Recio-Fernandez, E. et al. Über die Auswirkungen einer HIV-Infektion und auf Integrasehemmern basierende Therapien auf das orale Bakteriom hinaus. Sci Rep 13, 14327 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41434-5

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Eingegangen: 20. März 2023

Angenommen: 26. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41434-5

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