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Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 878 (2023) Diesen Artikel zitieren
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Details zu den Metriken
Infektionen durch Clostridioides difficile, ein Bakterium, das den Dickdarm (Kolon) befällt, betreffen weltweit eine große Anzahl von Menschen. Die bakterielle Besiedlung wird durch zwei Exotoxine vermittelt: die Toxine A und B. Kurze Peptide, die an den Darm abgegeben werden können und die biokatalytische Aktivität dieser Toxine hemmen, stellen eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Vorbeugung und Behandlung von C. diff dar. Infektion. Wir beschreiben einen Ansatz, der einen Peptide Binding Design (PepBD)-Algorithmus, Simulationen auf molekularer Ebene, einen schnellen Screening-Assay zur Bewertung der Peptid-Toxin-Bindung, einen primären humanzellbasierten Assay und Oberflächenplasmonresonanzmessungen (SPR) zur Entwicklung von Peptiden kombiniert Inhibitoren, die Toxin A in den Epithelzellen des Dickdarms blockieren. Es wurde festgestellt, dass ein Peptid, SA1, die TcdA-Toxizität in primär abgeleiteten menschlichen Dickdarmepithelzellen (Dickdarm) blockiert. SA1 bindet TcdA mit einem KD von 56,1 ± 29,8 nM, gemessen durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR).
Clostridioides difficile (C. diff.) ist ein grampositives, sporenbildendes Bakterium, das den Darmtrakt von Menschen und Tieren infiziert. Im letzten Jahrzehnt wurde C. diff. Infektionen sind in Nordamerika und Europa die Hauptursache für Durchfall und Entzündungen des Dickdarms1. In vielen Fällen ist eine Infektion mit C. difficile die Folge eines mikrobiellen Ungleichgewichts, das durch eine Überbehandlung mit Antibiotika wie Penicillin, Carbapenem und Fluorchinolon2,3 verursacht wird. Diese stören das Darmmikrobiom und ermöglichen die Keimung von C. diff. Sporen und führt zur Vermehrung von Bakterien und der anschließenden Freisetzung virulenter Toxine. Im Jahr 2017 waren mehr als 200.000 Menschen mit C. diff infiziert. Allein in den Vereinigten Staaten kam es zu 12.800 Todesfällen4,5. Die meisten Infektionen stehen im Zusammenhang mit der stationären Behandlung und mehr als 80 % der Todesfälle ereignen sich bei Menschen über 65 Jahren6. Das Dickdarmepithel ist die primäre Infektionsstelle, da die Epithelzellen, die die Darmwand auskleiden, sehr empfindlich auf die Wirkung von C. diff-Toxinen reagieren und C. diff bevorzugt den Dickdarm besiedelt7,8.
Die Pathogenität von C. diff. entsteht hauptsächlich aus zwei Haupttoxinen: Toxin A (TcdA) und Toxin B (TcdB)9,10. C. diff. haftet mithilfe seiner Oberflächenproteine an der Darmwand und produziert zwei große Rho-glucosylierende Toxine, TcdA und B, die eine Sequenzhomologie von ca. 63 % aufweisen11,12. Diese Toxine umfassen vier Domänen: Glucosyltransferase-Domäne (GTD), Autoprotease-Domäne (APD), Abgabedomäne und die kombinierte repetitive Oligopeptid-Domäne (CROP) (Abb. 1a). Der C.-Diff. Toxine wirken über einen vierstufigen intrazellulären Mechanismus (Abb. 1b): (1) Die CROP-Domäne, die sich am C-Terminus der Toxine befindet, bindet an Kohlenhydratmoleküle und Proteine auf der Oberfläche von Dickdarmepithelzellen13,14,15 ; (2) die Abgabedomäne hilft bei der Translokation des Toxins in das Zytosol der Zielzellen; (3) die APD spaltet die GTD vom Rest des Toxins ab; und (4) die GTD nutzt Uridin-Diphosphat-Glukose (UDP-Glukose), um GTPasen der Rho-Familie zu glukosylieren, die in Darmepithelzellen vorhanden sind. Die Glukosylierung dieser GTPasen der Rho-Familie stört die Transkription, das Fortschreiten des Zellzyklus, die Apoptose und die Regulierung des Zytoskeletts, was zu zytopathischen und zytotoxischen Wirkungen führt16,17,18,19.
a Die Kristallstruktur von Toxin A mit der Glucosyltransferase-Domäne (GTD, rot), der Autoprotease-Domäne (APD, blau) und der Abgabedomäne (orange) (PDB-ID: 4R04) ist dargestellt. b Schematische Darstellung der TcdA-induzierten Toxizität in menschlichen Epithelzellen. c Die katalytische Stelle von TcdA (blau dargestellt) im GTD (rot) spielt eine wichtige Rolle bei der Induktion von C. diff. Infektion.
Zur Behandlung von C. diff wurden mehrere Therapieansätze entwickelt. Infektion. Die Standardbehandlung ist die Behandlung mit Antibiotika (Metronidazol und Vancomycin), aber in 20 % der Fälle kommt es erneut zu einer Infektion20. Die Exposition gegenüber diesen Antibiotika verändert die mikrobielle Gemeinschaft im Darm und erleichtert die Kolonisierung durch C. diff21. Merck führte einen monoklonalen Antikörper, Bezlotoxumab (vermarktet als Zinplava), ein, der auf das C. diff-Toxin B abzielt. Während die Rate wiederkehrender Infektionen bei Patienten, die Bezlotoxumab erhielten, wesentlich niedriger war als bei mit Antibiotika behandelten Kohorten, waren die hohen Kosten einer Einzeldosis (~ 4.000 US-Dollar) und die intravenöse Infusion sind belastend22,23. Ein weiterer C. diff. Bei der Behandlung handelt es sich um eine fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT), eine Prüfbehandlung, die noch nicht von der FDA zugelassen ist24. Die Methoden der FMT-Verabreichung und die optimalen Dosierungsstrategien variieren immer noch von Fall zu Fall. Darüber hinaus birgt FMT das Risiko der Übertragung von Infektionskrankheiten und antibiotikaresistenten Bakterien25.
Kurze Peptide sind vielversprechende Kandidaten für die Prävention und Behandlung von C. diff. Infektionen, da sie kostengünstig sind und spezifisch wirken können. Ziel dieser Studie ist es daher, Peptidinhibitoren zu identifizieren, die die katalytische Domäne von C. diff binden. Toxin A GTD durch Kombination von Computerdesign, Simulationen auf molekularer Ebene und experimenteller Verfeinerung. Dazu verwenden wir PepBD, einen in unserer Gruppe entwickelten Algorithmus für das Computational Peptide Binding Design (PepBD), der ein Hochdurchsatz-Screening von Peptidbindern an biomolekulare Ziele26,27,28,29, z. B. Proteine und RNA, durchführt. Der PepBD-Algorithmus wurde in der Vergangenheit erfolgreich eingesetzt, um 15-mer-Transfer-RNALys3-bindende Peptide30, Peptide, die kardiales Troponin I31 und Neuropeptid Y32 erkennen, Peptidliganden, die an die Fc- und Fab-Domänen von Immunglobulin G33 binden, und Peptide, die binden, zu entwerfen zur Rezeptorbindungsdomäne des SARS-CoV-2-Spike-Proteins35. Um die rechnerisch vorgeschlagenen Peptide einzustufen und zu bewerten, wurde eine mikrofluidische Plattform auf Perlenbasis verwendet, um schnell Peptide zu identifizieren, die die gewünschten Bindungseigenschaften aufweisen. Dieses System nutzt Fluoreszenzbildgebung und automatisierte Bildanalyse, um die Neigung zur On-Target- und Off-Target-Bindung zu messen und wurde bereits früher zur Identifizierung von Peptiden eingesetzt, die spezifisch an Cas9-, VCAM-1- und IgG-Fab-Fragmente binden36,37,38. Die Wirksamkeit der Peptide wird über einen transepithelialen elektrischen Widerstandstest (TEER) an Monoschichten des menschlichen Darmepithelkulturmodells und über Oberflächenplasmonresonanzmessungen getestet.
Der Ausgangspunkt für die in diesem Artikel beschriebene Arbeit ist unser zuvor rechnerisch identifiziertes 10-mer-Peptid „NPA“, das an TcdA GTD39 bindet. Als Proteinziel haben wir uns für TcdA GTD entschieden, da es auf der im Feig-Labor an der Wayne State University durchgeführten Forschung aufbaut und den ungedeckten Bedarf an wirksamen Therapeutika gegen TcdA40 deckt. In ihrer Studie verwendeten sie Phagendisplay, um kurze Peptide zu identifizieren, die eine Bindungsaffinität zu TcdA GTD zeigen. Dieses Peptid neutralisiert TcdA in differenzierten absorbierenden Zellen des Dünndarms (SI), hat jedoch keine Wirkung auf differenzierte absorbierende Zellen des Dickdarms. Während die Mechanismen für diese Beobachtung unbekannt sind, besteht eine mögliche Erklärung darin, dass am Bürstensaum von SI-Zellen vorhandene Proteasen die 10-mer-Peptide in kürzere, aktivere Formen spalten, die die Toxine in den SI-Zellen neutralisieren. Da die Epithelzellen des Dickdarms keine nennenswerten Proteasen exprimieren41, ist die Wahrscheinlichkeit, dass die 10-mer-Peptide in Dickdarmzellen gespalten werden, geringer als in SI-Zellen, und sie können daher die Toxine in den Dickdarmzellen nicht neutralisieren.
In dieser Arbeit entwerfen wir rechnerisch konstruierte Varianten des NPA-Peptids, die kürzer als 10 Aminosäuren sind, mit dem Ziel, wirksame Inhibitoren von C. diff zu identifizieren. TcdA. Wir beginnen mit der Durchführung von Molekulardynamiksimulationen von NPA-Fragmenten, um zu sehen, welche von ihnen an die katalytische Stelle von TcdA GTD binden können. Die Simulationsergebnisse sagen voraus, dass 8-mer-Peptidkandidaten optimal sind. Daher wenden wir den PepBD-Algorithmus an, um 8-mer-Peptidsequenzen mit 8-mer-NPA als „Referenzpeptid“ zu entwerfen. Es werden explizite atomistische MD-Simulationen des Lösungsmittels und Berechnungen der freien Bindungsenergie durchgeführt, um die Bindung der in silico vorgeschlagenen Peptide an das TcdA-GTD in Lösung zu bewerten. Die Peptide werden mithilfe eines hauseigenen, auf Perlen basierenden Peptidanzeigesystems schnell auf TcdA-Bindung und TcdA-GTD-Bindung untersucht, um schwache Peptidinhibitoren zu eliminieren. Die Wirksamkeit der Peptide, die es durch den Bead-basierten Peptid-Display-Assay schaffen, wird mithilfe eines transepithelialen elektrischen Widerstandstests (TEER) an Monoschichten des menschlichen Darmepithelkulturmodells getestet. Während herkömmliche Zelltoxizitätstests für C. diff-Toxine nicht physiologisch relevante Dickdarmkrebszellen oder transformierte Nierenepithelzellen verwenden, verwenden wir hier primäre menschliche Darmepithelstammzellen aus dem Dickdarm (absteigender Dickdarm), die in der Hauptlinie (absorptiv) differenziert sind ) der Darmschleimhaut. Die experimentelle Bindungsaffinität des leistungsstärksten Peptids zu TcdA wird mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) charakterisiert.
Die Höhepunkte unserer Ergebnisse sind wie folgt. Sieben mögliche Peptidinhibitoren (SA1-SA7) wurden mithilfe unseres PepBD-Algorithmus in Verbindung mit Simulationen auf molekularer Ebene identifiziert. Basierend auf dem Bead-basierten Peptid-Anzeigebildschirm für die TcdA-GTD-Bindung wurden vier Peptide (SA1-SA4) für die weitere In-vitro-Bewertung ausgewählt. SA1 war das einzige Peptid, das neutralisierende Eigenschaften von TcdA im Dickdarm zeigte. Die mittels SPR gemessene Dissoziationskonstante KD von SA1 zu TcdA beträgt 56,1 ± 29,8 nM. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Peptid SA1 ein wirksames therapeutisches Medikament zur Behandlung von C. diff sein könnte. Infektion.
Wir begannen damit, zu bestimmen, welches NPA-Fragment die wichtigste Rolle bei der Bindung an die katalytische TcdA-GTD-Domäne spielt, da dieses Fragment dann als Referenzpeptid in unserem Designprozess dienen kann. NPA wurde in unserer vorherigen Studie39 identifiziert, in der rechnerisch entworfene 10-mer-Peptidsequenzen (Ergänzungstabelle 1) beschrieben wurden, die experimentell mithilfe eines funktionellen Zellkulturassays auf ihre Fähigkeit getestet wurden, TcdA im Dünndarm (Jejunum) und Dickdarm (Kolon) zu neutralisieren ) Zellen. Das zur Initialisierung des Computerdesigns in dieser Studie verwendete Referenzpeptid war RP: EGWHAHTGGG (Abb. 2a), das von Feigs Team an der Wayne State University41 mittels Phagendisplay entdeckt und experimentell bestätigt wurde, dass es die Glucosyltransferase-Aktivität von TcdA hemmt. Mithilfe unseres PepBD-Algorithmus26,27,28,29 und Molekulardynamiksimulationen haben wir das Peptid NPA: DYWFQRHGHR (Abb. 2c) identifiziert, das an TcdA GTD bindet. Die kritischen Reste auf RP, die an der Bindung an TcdA GTD beteiligt sind, sind E1, W3, H4 und H6, während die kritischen Reste auf NPA, die an der Bindung an TcdA GTD beteiligt sind, W3, R6 und H9 sind. Die wichtigsten interagierenden Reste auf TcdA GTD befinden sich innerhalb der reaktiven Schleife, nämlich. Reste 509–526. Eine detaillierte Analyse der Rest-Rest-Wechselwirkung zwischen RP:TcdA GTD und NPA:TcdA GTD finden Sie in unserer vorherigen Arbeit39. Die Aminosäuresequenzen der Reste 509–526 sind in der Ergänzenden Anmerkung 1 angegeben. Die Peptide RP und NPA zeigten eine toxinneutralisierende Aktivität in Jejunumzellen, zeigten jedoch keine Wirkung in den Dickdarmzellen. Da Zellen des Dünndarms Proteasen an der Bürstengrenze der Zelle exprimieren, um Nahrungsproteine abzubauen41, vermuteten wir, dass NPA bei der Anwendung auf Jejunumzellen in kleinere Fragmente mit neutralisierender Aktivität gespalten wurde. Wir führten LC-MS/MS an Zellkulturüberständen von Kolon-Monoschichten nach Peptid-NPA durch und bestätigten das Vorhandensein kürzerer Peptide, die von NPA voller Länge abgeleitet waren. Dies ist nicht überraschend, da die Expression häufiger Proteasen im Dickdarm nahezu fehlt42. Basierend auf der Annahme, dass Peptide, die kleiner als 10-mere sind, als stärkere Toxininhibitoren wirken könnten, haben wir unseren rechnerischen Designansatz modifiziert.
ein Peptid-RP (EGWHAHTGGG) an der katalytischen Stelle der Toxin-A-Glucosyltransferase-Domäne und (b) die restweise Zerlegung des Wechselwirkungsenergiediagramms von Peptid-RP. c Peptid-NPA (DYWFQRHGHR) an der katalytischen Stelle der Toxin-A-Glucosyltransferase-Domäne und (d) die restweise Zerlegung des Wechselwirkungsenergiediagramms von Peptid-NPA. Die TcdA-GTD ist rot dargestellt und das Peptid ist blau gefärbt. e Tabelle mit Vorhersagen aus der Molekulardynamiksimulation darüber, ob die 6-mer-, 7-mer- und 8-mer-Fragmente auf RP und NPA an TcdA GTD binden (f) Ausgangsstruktur für PepBD: Referenzpeptid NPA (8-mer) an die TcdA-GTD am katalytischen Zentrum mit einem \({\triangle G}_{{Bindung}}\) von −6,35 kcal/mol gebunden.
Basierend auf den oben beschriebenen experimentellen Beobachtungen testeten wir mithilfe von Simulationen auf molekularer Ebene, ob Peptide, die kürzer als 10-mere sind, an die TcdA-GTD binden können. Zunächst führten wir atomistische Molekulardynamiksimulationen von RP und NPA durch, die an die katalytische Domäne von TcdA GTD gebunden waren. Es wurden Diagramme der Wechselwirkungsenergie (Van-der-Waals-Terme + elektrostatische + polare Solvatationsenergieterme) jedes der zehn Reste entlang der Peptidsequenz mit der katalytischen Stelle von TcdA GTD erstellt. Die Ergebnisse zeigen, dass Reste am N-Terminus der Peptide einen höheren Beitrag zur Wechselwirkungsenergie mit der katalytischen Stelle von TcdA GTD leisten als die flankierenden Reste am C-Terminus der Peptide (Abb. 2b, d). Zweitens simulierten wir 6-, 7- und 8-mer-Fragmente der Peptide RP und NPA, die an die katalytische Domäne von TcdA GTD gebunden waren. Die Simulationen zeigen, dass die 6-mer- und 7-mer-Fragmente von RP, EGWHAH und EGWHAHT nicht stabil \((dh\,{{{{{\boldsymbol{\triangle }}}}}}{G}_{ {Bindung}} > 0)\) in der Nähe der Bindungsstelle von TcdA GTD, wohingegen das 8-mer-Fragment EGWHAHTG mit einer freien Bindungsenergie von \({{{{{\boldsymbol{\triangle }}}} an TcdA GTD bindet }}{G}_{{Bindung}}=-5,79\frac{{kcal}}{{mol}}\)). Im Gegensatz dazu sind sowohl die 7-mer- als auch die 8-mer-Fragmente von NPA, nämlich 7-mer DYWFQRH und 8-mer DYWFQRHG (\({{{{{\boldsymbol{\triangle }}}}}}{G}_{ {Bindung}}\,{{{{{\rm{für}}}}}}\,8-{{{{\rm{mer\; NPA}}}}}}=-6,35\frac{{ kcal}}{{mol}}\)) zeigen eine gute Bindungsaffinität für das TcdA GTD (Abb. 2e). Dementsprechend haben wir beschlossen, 8-mer-Peptidvarianten unter Verwendung von DYWFQRHG als Referenzligand für den PepBD-Algorithmus zu entwerfen.
PepBD ist ein Monte-Carlo-basierter Algorithmus für das Peptidbindungsdesign, der ein iteratives Verfahren verwendet, um die Bindungsaffinität und Selektivität von Peptiden an ein biomolekulares Ziel zu optimieren. Der Algorithmus nutzt als Eingabe die Struktur des Komplexes, der zwischen einer anfänglichen Peptidsequenz (Referenzpeptid) und dem Zielbiomolekül gebildet wird, und wählt Peptidvarianten aus, indem er Sequenz- und Konformationsänderungsbewegungen an der Peptidkette implementiert. Die gewünschten Hydratationseigenschaften der entworfenen Peptide können basierend auf 6 Resttypen (hydrophob, hydrophil, positiv, negativ, andere und Glycin) angepasst werden. Die Klassifizierung der 20 natürlichen Aminosäuren in die sechs Resttypen finden Sie in der Ergänzungstabelle 2. Eine Score-Funktion, \({\varGamma }_{{score}}\), die (i) die Bindungsenergie der berücksichtigt Peptid an den Rezeptor und (ii) die Konformationsstabilität des Peptids bei Bindung an den Rezeptor wird verwendet, um die Akzeptanz neuer Peptidkandidaten zu bewerten. Einzelheiten zum Algorithmus finden Sie im Abschnitt „Methoden“.
Wir haben den PepBD-Algorithmus implementiert, um einen verbesserten Satz von Peptidinhibitoren zu identifizieren, wobei wir den 8-mer NPA:TcdA GTD-Komplex (Abb. 2f) als Eingabestruktur verwenden. Der \({{{{{\boldsymbol{\triangle }}}}}}{G}_{{Bindung}}\) von 8-mer NPA, gebunden an das TcdA GTD, beträgt −6,35 kcal/mol. Unser Ziel ist es, PepBD zu nutzen, um neue Sequenzen zu generieren, die mit höherer Bindungsaffinität als 8-mer-NPA an die TcdA-GTD binden können. Wir untersuchten drei Fälle mit unterschiedlichen Hydratationseigenschaften für die Peptidkette. In allen drei Fällen stellen wir Diversität in der Aminosäurezusammensetzung der Peptidkette sicher, indem wir ein Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Beiträgen zur Bindungsenergie ermöglichen, nämlich elektrostatische, hydrophobe, Wasserstoffbrückenbindungen, π-π usw., die zur Affinität und Affinität des Peptids beitragen Selektivität. Die drei Fälle sind wie folgt. Fall eins: Nhydrophob = 3, Nhydrophil = 2, Npositiv = 2, Nnegativ = 1, Nother = 0 und Nglycin = 0, Fall zwei: Nhydrophob = 3, Nhydrophil = 2, Npositiv = 1, Nnegativ = 1, Nother = 0 und Nglycin = 1 und Fall drei: Nhydrophob = 1, Nnegativ = 3, Npositiv = 2, Nnegativ = 1, Nother = 0 und Nglycin = 1. Für jeden Fall führen wir die PepBD-Suche mit drei verschiedenen anfänglichen Zufallsstartwerten durch, um die anfängliche zu randomisieren Peptidsequenz. Dies ermöglicht es unseren Designs, verschiedene Suchpfade zu verfolgen und Peptide aus einem großen Pool von Peptidsequenzen und -konformationen zu entnehmen. Während der In-silico-Evolution werden durch Mutation und Austausch von Aminosäuren an der Peptidkette neue Sequenzen und Konformere erzeugt, was zu einer Schwankung des Scores führt. Ein niedrigerer Γ-Score bedeutet eine stärkere Bindungsaffinität eines Peptids zum gebundenen Ziel. Die quadratische Mittelwertabweichung (RMSD) der neuen Peptidkonformer im Vergleich zur Konformation der ursprünglichen Peptidkette spiegelt die Veränderungen im Grundgerüst des Peptids im Verlauf des Designprozesses wider. Abb. 3a zeigt den Γscore und das RMSD-Profil im Vergleich zur Anzahl der Sequenz- und Konformationsänderungsbewegungen, die mit einem bestimmten anfänglichen Zufallskeim für Fall 1 durchgeführt wurden. Abb. 3b zeigt die Struktur eines der leistungsstärksten Peptide, SA1: EFWWRRHN, komplexiert mit die TcdA GTD-Bindungsschnittstelle aus Fall 1 (Random Seed 1). Peptid SA1 hat einen Γscore = −44,59, der im 459. Schritt der Sequenzentwicklung erhalten wurde. Aus Fall 2 (zufälliger Startwert 3) ist das leistungsstärkste Peptid SA3 QEWMGRHW (Ergänzende Anmerkung 2, ergänzende Abbildung 1A, C), und aus Fall 3 (zufälliger Startwert 3) ist das leistungsstärkste Peptid SA6 EGWQHRHR (Ergänzende Anmerkung 2, ergänzende Abbildung 1A, C). Abb. 1B, D); Weitere Informationen zu SA3 und SA6 sowie den Fällen 2 und 3 finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 2. Eine umfassende Liste der wichtigsten von PepBD erhaltenen Peptidsequenzen mit ihrem entsprechenden Fall, Zufallsstartwert, \({\varGamma }_{{score} }\), \({\triangle G}_{{binding}}\)-Werte und ob sie experimentell ausgewertet wurden oder nicht, sind in der Ergänzungstabelle 3 angegeben.
a Der Score/RMSD im Vergleich zur Anzahl der Sequenz- und Konformationsschritte für Fall 1 mit einem eindeutigen anfänglichen Zufallskeim ergibt (b) Peptid SA1: EFWWRRHN (c) Schnappschuss des an TcdA GTD gebundenen Peptids SA1, erhalten aus der Molekulardynamiksimulation. Die Konformation des Peptids an der Bindungsschnittstelle wird gezeigt. d Diagramm, das die restweise Zerlegung der Wechselwirkungsenergie (Van-der-Waals- + elektrostatischer + polarer Solvatationsenergiebeitrag) im SA1:TcdA-GTD-Komplex zeigt.
Sobald die In-silico-Evolution beendet ist, führen wir explizite atomistische Molekulardynamiksimulationen (MD) der Komplexe durch, die zwischen den Peptiden mit der niedrigsten Bewertung und TcdA-GTD gebildet werden, um ihre Bindungsaffinität vorherzusagen. Es ist zu beachten, dass \({\varGamma }_{{score}}\) kein genaues Maß für die freie Bindungsenergie eines an TcdA GTD gebundenen Peptids ist, sondern vielmehr eine wichtige Metrik, die wir bei der Auswahl verwenden können Peptide, die wir gerne weiterentwickeln würden, um explizite Lösungsmittel-MD-Simulationen durchzuführen. Für jeden Peptid:TcdA-GTD-Komplex werden drei unabhängige Simulationen für 100 ns durchgeführt, um sicherzustellen, dass das System einen Gleichgewichtszustand erreicht. Die Simulationen werden bei 298 K mit dem Kraftfeld AMBER ff14SB und dem Paket AMBER18 durchgeführt. Wir berechnen das \({\triangle G}_{{binding}}\) des Peptid:Rezeptor-Komplexes nach den MD-Simulationen unter Verwendung des MMGBSA-Protokolls und der Methode der variablen Dielektrizitätskonstante. Einzelheiten zu unserer atomistischen MD-Simulation und dem \({\triangle G}_{{binding}}\)-Berechnungsverfahren finden Sie unter Methoden und ergänzendes Material26,27,28,29,43. In Tabelle 1 sind die Top-Peptide aufgeführt, die wir aus unserem Berechnungsverfahren erhalten, sowie ihre entsprechenden Bewertungen und \({\triangle G}_{{binding}}\)-Werte. Wir führten einige 500-ns-Simulationen an ausgewählten Peptid:Protein-Komplexen durch und kamen zu dem Schluss, dass es über lange Zeiträume keine größeren Konformationsänderungen gab (siehe Ergänzende Anmerkung 3, Ergänzende Abbildung 2, Ergänzende Tabellen 4 und 5). SA1 ist das vielversprechendste Peptid mit einem \({\triangle G}_{{binding}}\)-Wert von −15,94 kcal/mol. (Hinweis: Je niedriger der Wert von \({\triangle G}_{{binding}}\), desto höher ist die Bindungsaffinität.) Der SA1:TcdA-GTD-Komplex, der durch Durchführung einer hierarchischen Clusteranalyse für die letzten 5 ns einer 100-ns-MD-Simulation erhalten wurde, ist in Abb. 3c dargestellt. Darüber hinaus ist in Abb. 3d die Darstellung der rückstandsweisen Zersetzung der Wechselwirkungsenergie zwischen SA1 und der katalytischen Stelle von TcdA GTD dargestellt. Die Darstellung zeigt, dass die entscheidenden SA1-Reste, die an der TcdA-GTD-Bindung beteiligt sind, Trp3, Trp4, Arg5, Arg6, His7 und Asn8 sind. Somit sind Tryptophan, Arginin, Histidin und Asparagin auf SA1 die vier essentiellen Aminosäuren für die TcdA-GTD-Bindung. Eine ausführliche Diskussion der wichtigsten Aminosäurewechselwirkungen von SA1 mit TcdA GTD finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 4 und in der Ergänzenden Abbildung 3. Aminosäuresequenzsignaturen in C. diff TcdA GTD-bindenden Peptiden wurden aus der Restzusammensetzung des oberen 1 % von abgeleitet die von PepBD für die Fälle 1 und 2 identifizierten Peptide mit der niedrigsten Bewertung (siehe Ergänzende Anmerkung 5, Ergänzende Abbildung 4, Ergänzende Tabelle 6).
Die von PepBD vorgeschlagenen Peptidinhibitorkandidaten wurden vorab in vitro auf eine starke und selektive TcdA-GTD-Bindung untersucht, um schwache Inhibitoren vor den zellbasierten Tests zu eliminieren. Eine starke Hemmung der TcdA-Glucosyltransferase-Aktivität beruht auf der Fähigkeit der Peptide, das Substrat der TcdA-GTD, UDP-Glucose, zu übertreffen. Angesichts der relativ niedrigen Michaelis-Konstante von TcdA (KM ~ 4,5 μM) im Vergleich zur zellulären Konzentration seines Substrats UDP-Glucose (92 μM) ist es besonders wichtig, dass die Peptide eine hohe Bindungsstärke und Selektivität für TcdA GTD aufweisen (ausführliche Informationen finden Sie im Zusatzmaterial). Analyse)11,44,45,46,47.
Unter Verwendung eines von unserem Team in früheren Arbeiten entwickelten mikrofluidischen Screening-Systems implementierten wir einen Dual-Fluoreszenz-Assay, um die TcdA-GTD-Hemmaktivität der Peptidkandidaten SA1-SA7, 8-mer NPA und 8-mer RP zu bewerten (Abb. 4a). ). Jede Peptidsequenz wurde auf einer durchscheinenden ChemMatrix-Aminomethyl-Perle immobilisiert, die dann mit rot fluoreszierend markiertem TcdA (TcdA-AF594) und einem grün fluoreszierenden Analogon von UDP-Glucose (UDP-Glucose-Fluorescein) in Kontakt gebracht wurde. Perlen mit Peptiden, die an TcdA binden, weisen ein rotes Fluoreszenzsignal auf; Perlen zeigen grüne Fluoreszenz, wenn UDP-Glucose-Fluorescein an die katalytische Stelle des TcdA-GTD bindet. Daher zeigen Peptide, die selektiv an die TcdA-GTD binden und das UDP-Glucose-Fluorescein von der katalytischen Stelle verdrängen können, rote, aber keine grüne Fluoreszenz. Die Perlen werden mit einem Hochdurchsatztest (350 Perlen pro Stunde) analysiert, der die Fluoreszenzintensität der Perlen mit der Bindungsstärke und Selektivität der angezeigten Peptide korreliert. Bilder jeder Perle werden über einen benutzerdefinierten Algorithmus analysiert, der eine konsistente und objektive Charakterisierung der Perlen innerhalb eines überprüften Ensembles gewährleistet.
ein Schema für die Perlenerfassung und -bildgebung auf einem kundenspezifischen Mikrofluidikgerät und Mikroskop. b Mittlere Rot- und Grünintensität (0–255 Pixelwert) der 90. Perzentil-Rotfläche (TcdA-Halo) der Perlen, die jedes Peptid anzeigen (Anzahl der Perlen (n) = 23, 20, 25, 19, 23, 21, 15, 36 , 14, 8, 7). RP (-T) und RP (-T -U) sind keine TcdA-AF594- bzw. keine TcdA-AF594/UDP-Glucose-Fluorescein-Kontrollen. c Prozentuale Änderung der grünen Fluoreszenz vom 90. Perzentil des roten Halo-Bereichs zum 50. Perzentil des grünen Bereichs; Negativere Werte deuten auf den Ausschluss von UDP-Glucose von der Peptid:TcdA-Schnittstelle und damit auf eine selektive Peptidbindung an die TcdA-GTD hin (* p < 0,005). d Repräsentative rote und grüne zusammengesetzte Bilder für jedes Peptid.
Perlen mit TcdA-bindenden Peptiden akkumulieren TcdA-AF594 auf ihrer Oberfläche, was zu einer charakteristischen roten Halo-Fluoreszenz führt. Dies liegt daran, dass TcdA ziemlich groß ist (MW = 308 kDa, 2710 Reste) und daher schlecht in die engen Poren der Perlen diffundiert. Die Intensität des Halos korreliert mit der Menge an gebundenem TcdA-AF59438 (Abb. 4b). Perlen, die selektive TcdA-GTD-bindende Peptide aufweisen, verdrängen UDP-Glucose-Fluorescein aus dem GTD, und somit kann die Peptid:TcdA-GTD-Bindung als Verlust der grünen Fluoreszenz44 aus der TcdA-Bindungsregion beobachtet werden (Abb. 4c).
Die Leistung der Peptide (SA1-SA7, 8-mer NPA und 8-mer RP) wurde basierend auf der Intensität der roten Halo-Fluoreszenz bzw. dem Verlust der grünen Fluoreszenz der Perlen abgeleitet (Abb. 4d). SA1 war das vielversprechendste TcdA-Bindungspeptid mit der höchsten mittleren roten Halo-Fluoreszenz. Trotz hoher grüner Fluoreszenz gab es eine signifikante (p = 0,0011) Verringerung der grünen Fluoreszenz von der Mitte der Perlen bis zur Peptid:TcdA-Bindungsschnittstelle im Vergleich zur Kontrolle ohne TcdA-AF594 ohne UDP-Glucose-Fluorescein ( RP(-T -U)) (Abb. 4c), was bedeutet, dass SA1 selektiv an TcdA GTD band. SA1, SA2, SA3 und SA4 hatten eine höhere mittlere rote Halo-Fluoreszenz und damit eine höhere TcdA-Bindung als 8-mer-NPA. SA1, SA3 und SA4 hatten eine höhere mittlere rote Halo-Fluoreszenz und damit eine höhere TcdA-Bindung als 8-mer-RP. Bemerkenswerterweise zeigten alle gescreenten Peptide eine Bindung an TcdA, allerdings zeigten die Peptide aus den Fällen 1 (SA1, SA2, SA4) und 2 (SA3, SA5) eine deutlich bessere Leistung als die aus Fall 3 (SA6, SA7). Alle Peptide außer SA7 zeigten eine signifikante (p < 0,005) Abnahme der grünen Fluoreszenz vom Zentrum zur Halo-Region (TcdA-Bindung), was auf einen relativ universellen Ausschluss von UDP-Glucose aus der Peptid:TcdA-Schnittstelle hinweist (Abb. 4d). Trotz Unterschieden in der grünen Hintergrundfluoreszenz zwischen Peptiden lieferte die gleichmäßige Abnahme der grünen Fluoreszenz am TcdA-Halo nur wenige Informationen zur Unterscheidung zwischen Peptiden. Die selektive Bindung der meisten von PepBD entwickelten Peptide an das TcdA GTD zeigt die Robustheit des Peptid-Design-Algorithmus zur zuverlässigen Identifizierung von Peptidbindern an bestimmten Taschen. Für die weitere Bewertung wurden die Peptide SA1–SA4 ausgewählt, die eine höhere rote Fluoreszenz als NPA aufwiesen und daher eine TcdA-Bindung versprachen.
Die Peptide SA1–SA4 wurden auf einem humanen Kolonepithelkultursystem gescreent, um vorläufig die neutralisierenden Fähigkeiten zu bewerten. In diesem Testsystem werden epitheliale Stammzellen des Dickdarms auf Transwell-Einsätze aufgetragen und bis zur Konfluenz auf der durchlässigen Membran des Einsatzes kultiviert (Abb. 5a, b). Sobald die Zellbarriere nach etwa 4 Tagen der ISC-Expansion (intestinale Stammzellen) erreicht ist, wird das Medium geändert, um die Differenzierung in die primäre Absorptionslinie des Dickdarms und den Zelltyp zu fördern, der den Toxinen von C. difficile am stärksten ausgesetzt ist48,49,50. Tight-Junction-Proteine werden hochreguliert, wodurch die Barrierefunktion der zellulären Monoschicht erhöht und der Ionenfluss verringert wird, der als transepithelialer elektrischer Widerstand (TEER) gemessen wird51. Die Toxizität wird im Laufe der Zeit als Abfall des TEER gemessen, was auf TcdA-abhängige Veränderungen im Zytoskelett hinweist, die zu undichten Tight Junctions führen. Für das Schnellscreening wurden Peptide mit differenzierten Kolonepithel-Monoschichten 2 Stunden lang vorinkubiert, dann wurde TcdA in einer Konzentration von 30 pM zugegeben, was der im Stuhl von C. diff-Patienten beobachteten Konzentration entspricht51. SA1 zeigte im Primärscreening einige neutralisierende Fähigkeiten, wie durch die Erhaltung des TEER im Vergleich zu Bedingungen mit TcdA ohne SA1 beobachtet wurde. Da SA1 eine vielversprechende neutralisierende Aktivität zeigte, wurde es mit demselben TcdA-Toxizitätstest ausführlicher auf Wirksamkeit getestet. Wie erwartet reagierten die Monoschichten des Dickdarms 12 Stunden nach der TcdA-Exposition mit einem nahezu vollständigen Verlust des TEER. Die Vorexposition der Monoschichten mit SA1 führte jedoch zu einem Schutz von ~79 % vor TcdA-Toxizität (Abb. 5c). Diese Daten belegen die Fähigkeit von SA1, die Barrierefunktion in Gegenwart klinisch relevanter TcdA-Konzentrationen zu schützen.
a Zusammenfassung des experimentellen Designs und Schema der menschlichen ISC-Expansion in definierten Medien (EM) menschlicher Kolonepithel-Monoschichten auf Transwells (a). Zwangsdifferenzierung mit definierten Medien (DM) (b). c TEER-Messungen an differenzierten Colon-Monoschichten (absteigend), behandelt mit DM (Medium mit Vehikel), TcdA und TcdA mit SA1. Die Werte werden als % von TEER bei t = 0 ausgedrückt, wenn TcdA zu den Kulturen hinzugefügt wurde. Einfaktorielle ANOVA p < 0,005, Mehrfachvergleichstests 12 h-20 hp < 0,05.
Mithilfe der Oberflächenplasmonenresonanz wurden wichtige kinetische Parameter für die SA1:TcdA-Bindung gemessen. SA1 war kovalent an eine gemischte bioresistente Thiol-selbstorganisierte Monoschicht (SAM) auf der Goldsensoroberfläche gebunden. Die Charakterisierung der Oberflächendicke und -zusammensetzung finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 6, Ergänzende Abbildungen. 5–7. Verschiedene Konzentrationen des Analyten TcdA wurden über die Oberfläche injiziert und die Nettowinkelreaktion in Grad aufgezeichnet. Die Menge des an die Oberfläche gebundenen Analyten TcdA wurde mithilfe eines zuvor beschriebenen gerätespezifischen Umrechnungsfaktors berechnet52. Die Nettogleichgewichtsreaktion wurde an eine Langmuir-Isotherme (Gleichung 1) angepasst, wie in Abb. 6a gezeigt, was zu einer Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD von 56,1 ± 29,8 nM und einer maximalen Bindungskapazität Qmax von 12,0 ± 2,2 nmol/ führte. m2.
a Maximale TcdA-Adsorption und TcdA-Konzentration passen sich einer Langmuir-Isotherme (Gleichung 1) an und ergeben KD und Qmax. b Experimentelle dynamische Reaktion (schwarze durchgezogene Linien), individuelle theoretische Anpassung (schwarze gestrichelte Linien) und durchschnittliche theoretische Anpassung (durchgezogene graue Linien, 95 %-Konfidenzintervall in Hellgrau) für TcdA-Konzentrationen oberhalb, unterhalb und ungefähr bei KD.
Die SA1:TcdA-Bindung ist eine Wechselwirkung mit mittlerer bis hoher Affinität, basierend auf ihrem mittelnanomolaren KD. Ein umfassenderes Bild der Bindung ergibt sich, wenn neben dem Gleichgewichtszustand auch die Kinetik berücksichtigt wird. Im Zusammenhang mit kompetitiven Inhibitoren ist eine schnelle Erkennung wichtig, die durch eine hohe Adsorptionsratenkonstante (ka) gekennzeichnet ist. Darüber hinaus ist eine komplexe Stabilität erwünscht, die sich in einer niedrigen Desorptionsratenkonstante (kd) widerspiegelt. Um als potenter kompetitiver TcdA-Inhibitor erfolgreich zu sein, muss SA1 UDP-Glucose um das aktive Zentrum verdrängen und sich langsam von diesem dissoziieren. Messungen der dynamischen Reaktion über TcdA-Injektionen ermöglichten die Berechnung von ka und KD unter Verwendung von Gleichung. 2, die in Tabelle 2 zusammengefasst und in Abb. 6b dargestellt sind.
Der durchschnittliche ka betrug 7,0 ± 2,5 × 10−5 nmol−1 s−1, was für einen Peptidinhibitor aufgrund seiner relativen Rückgratflexibilität hoch ist. Eine Durchsicht der Literatur zeigt, dass die Adsorptionsgeschwindigkeitskonstanten von Peptidinhibitoren typischerweise zwischen 10−7 und 10−6 nmol−1 s−1 liegen 53,54. Der durchschnittliche kd betrug 4,0 ± 1,4 × 10−3 s−1, was mit dem anderer Peptidliganden53,54,55,56,57 übereinstimmt. Im Vergleich zu Antikörper:Antigen-Bindungswechselwirkungen, die bekanntermaßen eine hohe Affinität aufweisen (typische KD liegen zwischen 10−8 und 10−11 M), weist SA1:TcdA (KD ~ 10−8 M) eine bemerkenswert hohe Bindungsaffinität für Nicht-Antikörper auf :Antigen-Bioerkennung58.
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, Leitpeptidkandidaten zu identifizieren, die an die katalytische Stelle der TcdA-Glucosyltransferase-Domäne binden und somit die Glucosyltransferase-Aktivität des Toxins TcdA hemmen können. In unserer vorherigen Arbeit berichteten wir über 10-mer-Peptide, die TcdA in differenzierten absorbierenden Zellen des Dünndarms (SI) neutralisieren konnten, aber keine Wirkung auf differenzierte absorbierende Zellen des Dickdarms zeigten. Eine wahrscheinliche Erklärung für diese Beobachtung ist, dass am Bürstensaum von SI-Zellen vorhandene Proteasen die 10-mer-Peptide in kürzere, aktivere Formen spalteten, die die Toxine in den SI-Zellen neutralisieren. Um diese Möglichkeit zu prüfen, führten wir eine Massenspektrophotometrie an den Medien durch, die das 10-mer-Referenzpeptid (EGWHAHTGGG40) enthielten, das mit SI-Zellen inkubiert worden war. Nach 20 Stunden Exposition gegenüber den SI-Zellen zeigte das Referenzpeptid 4 vorherrschende und kleinere Peptide und das 10-mer-Referenzpeptid voller Länge war die am wenigsten häufig vorkommende Spezies, was darauf hindeutet, dass das 10-mer durch SI-Proteasen gespalten wurde (ergänzende Abbildung 8). . Bei Dickdarmzellen würden wir diesen Effekt nicht erwarten, da sie im Allgemeinen keine Proteasen exprimieren42. Wir haben atomistische Molekulardynamiksimulationen durchgeführt, um zu testen, ob kürzere Peptide wirksamere Inhibitoren von C. diff sein könnten. TcdA als die 10-mer. Die Simulationen sagten voraus, dass 8-mer-Peptide eine optimale Peptidlänge aufweisen. Wir haben unseren PepBD-Algorithmus angewendet und ihn mit Molekulardynamiksimulationen und Berechnungen der freien Bindungsenergie kombiniert, um sieben 8-mer-Peptide (SA1-SA7) zu finden. Diese Peptide wurden mithilfe einer firmeneigenen mikrofluidischen Screening-Technik auf Perlenbasis schnell gescreent, um die selektive TcdA-GTD-Bindung zu überprüfen, und die schwachen Peptidinhibitoren (SA5-SA7) wurden eliminiert. Die Wirksamkeit der Peptide SA1–SA4 wurde mithilfe eines transepithelialen elektrischen Widerstandstests (TEER) an Monoschichten menschlicher Darmepithelstammzellen aus dem Dickdarm (absteigender Dickdarm) getestet. Das Peptid SA1 blockierte die TcdA-Toxizität in Dickdarmepithelzellen. Die Bindungsaffinität dieses Peptids an TcdA wurde mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) charakterisiert und die Dissoziationskonstante KD betrug 56,1 ± 29,8 nM.
Eines unserer zukünftigen Ziele ist die Entwicklung von Peptidinhibitoren, die an der katalytischen Stelle von TcdB GTD binden, da TcdB ein noch anspruchsvolleres und klinisch relevanteres Ziel als TcdA ist. Wir haben die Bindungsaffinität von SA1 für den TcdB GTD rechnerisch bewertet (Methode zusammengefasst in der Ergänzenden Anmerkung 7). Unsere rechnerischen Vorhersagen legen nahe, dass das Peptid SA1 eine niedrige Bindungsaffinität aufweist (\({{{{{\boldsymbol{\triangle }}}}}}{G}_{{Bindung}}=-1,56{kcal}/{mol}\ )) für die katalytische TcdB-GTD-Stelle. Daher ist SA1 selektiv gegenüber Tcd A.
Antitoxin-Medikamente (wie das hier entwickelte SA1) sind therapeutisch relevant, weil sie den Krankheitserreger (z. B. das Toxin) eliminieren. Antitoxin-Medikamente sind auch deshalb attraktiv, weil sie hochspezifisch sind (die Auswirkungen auf den Wirt oder die Mikrobiota außerhalb des Ziels begrenzen) und dem toxinproduzierenden Krankheitserreger, wenn überhaupt, nur geringe Fitnesskosten auferlegen (wodurch der Druck zur Resistenzentwicklung verringert wird). Auf diese Weise ergänzen Antitoxin-Medikamente die Standardantibiotika (und wirken möglicherweise synergistisch mit ihnen). Durch die Bindung an die katalytische Stelle des Toxins hemmt SA1 kompetitiv die wichtige krankheitsverursachende biochemische Reaktion von C. diff. Da das aktive Zentrum des Toxins die am höchsten konservierte Region des Toxins ist, hoffen wir außerdem, dass SA1 bei einer Vielzahl von C. diff-Stämmen aktiv ist und eine robuste Aktivität beibehält, wenn neue Stämme entstehen. SA1 stellt eine Verbesserung der Anti-TcdA-GTD-Peptidtherapeutika dar, die ähnlich wirksam ist, sich aber mechanistisch von kürzlich veröffentlichten niedermolekularen Glucosyltransferase-Inhibitoren unterscheidet59,60. Mit Blick auf die Zukunft verspricht die Leichtigkeit, mit der Peptide in großem Maßstab hergestellt werden können, den gleichberechtigten Zugang zu Antitoxin-Therapien zu verbessern und ermöglicht auch die Herstellung dieser Peptide am Ort der Krankheit mithilfe manipulierter Darmmikroben. Zusammenfassend veranschaulicht diese Arbeit einen strukturgesteuerten, rationalen Ansatz zur Entwicklung von Anti-Toxin-Peptiden, der leicht auf andere von C. diff und anderen antibiotikaresistenten Krankheitserregern abgesonderte Toxine übertragen werden kann.
N,N-Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan (DCM), Alexa Fluor 594 NHS Ester, N-Hydroxysuccinimid (NHS), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC), Natriumchlorid, HPLC-Qualität Acetonitril, Ameisensäure in HPLC-Qualität, Acetonitril in LCMS-Qualität, Ameisensäure in LCMS-Qualität, Pierce™ Farbstoffentfernungssäulen, Eisessig und Salzsäure wurden von ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) gekauft. Triisopropylsilan-Silan (TIS), Natriumhydroxid (NaOH), phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4, 1,2-Ethandithiol (EDT), Tween 20, Thioanisol, Phenol, 3 kDa MWCO Amicon Ultra Zentrifugalfilter und Glucose- UDP-Fluorescein-Konjugat wurde von Millipore-Sigma (Burlington, MA) gekauft. 30 % Wasserstoffperoxid, Kaiser-Testkits und Magnesiumchlorid wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) gekauft. 96 %ige Schwefelsäure wurde von Macron Fine Chemicals (Randor, PA) bezogen. Petrolether und Ethylether wurden von EMD Millipore Corporation (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Tris-HCl wurde von IBI Scientific (Peosta, IA) gekauft. Piperidin, Diisopropylethylamin (DIPEA), Trifluoressigsäure (TFA), 1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP), 2-(7-aza-1Hbenzotriazol-1-yl) −1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HATU). ), Fmoc-L-Arg(Pbf)-Wang-Harz, Fmoc-L-Trp(Boc)-Wang-Harz, Fmoc-L-Thr(tBu)-Wang-Harz, Fmoc-L-Pro-Wang-Harz, Fmoc-L -Asn(Trt)-Wang-Harz, Rink-Amid-Harz und alle Fmoc-geschützten Aminosäuren wurden von ChemImpex, Inc. (Wood Dale, IL) bezogen. ChemMatrix Aminomethylharz (0,7 mmol/g Funktionsdichte, 100–200 Mesh) wurde von PCAS Biomatrix, Inc. (Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Kanada) bezogen. Toxin A aus Clostridioides difficile wurde von List Biological Labs, Inc. (Campbell, CA) erworben. Bioresistente Alkantiole mit Hydroxyl-Endgruppen (HSC11(EG)3OH, 2-{2-[2-(1-mercaptoundec-11-yloxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethanol) und Carboxyl-Endgruppen (HSC11(EG)6OCH2COOH, (2- (2-(2-(2-(2-(2-(11-mercaptoundecyloxy)-ethoxy)-ethoxy)-ethoxy)-ethoxy)-ethoxy-essigsäure)) wurden von Prochimia Surfaces (Polen) erhalten. Goldsensor Die Objektträger wurden von BioNavis Ltd. (Tampere, Finnland) erhalten. Ethanol (200 Proof) wurde von Decon Labs, Inc (King of Prussia, PA) erhalten. Milli-Q-Wasser (MQ-Wasser, spezifischer Widerstand > 18 MΩ cm) wurde erhalten von unter Verwendung eines Millipore-Wasserreinigungssystems (Billerica, MA). Stickstoffgas und flüssiger Stickstoff wurden von Airgas National Welders (Raleigh, NC) bezogen.
Der PepBD-Algorithmus verwendet ein iteratives Verfahren, das Peptidsequenzen so optimiert, dass sie mit höherer Affinität und Spezifität an ein biomolekulares Ziel binden als ein bekannter Referenzligand. Der Designprozess ist unten zusammengefasst.
Eingabepeptid generieren: TcdA-GTD-Struktur: Die Eingabestruktur für den PepBD-Algorithmus war ein 8-mer-Fragment eines In-silico-Peptids, NPA, das zuvor identifiziert und experimentell verifiziert wurde, um TcdA in mit dem TcdA-GTD komplexierten Jejunumzellen zu neutralisieren.
Berechnen Sie den anfänglichen Score des Zufallspeptids: TcdA-Struktur: Eine zufällige Peptidsequenz wird generiert und auf das Rückgratgerüst des anfänglichen Peptids (NPA 8-mer) drapiert, das an das TcdA-GTD und seinen \({\varGamma }_{{score} gebunden ist. }\) ist berechnet.
Iteration von Peptidsequenz- und Konformationsänderungsbewegungen: Der Designalgorithmus führt 10.000 Evolutionsschritte durch und generiert Varianten des ursprünglichen Peptids, die durch zwei Arten von Bewegungen an das Zielprotein binden: Sequenzänderung (Mutation) und Konformationsänderung.
Werten Sie den Score \({\varGamma }_{{score}}\) der neuen Peptidsequenz/des neuen Peptidkonformers aus: Der Score der neu generierten Peptidsequenz oder des neu generierten Konformers im Komplex mit der TcdA-GTD wird ausgewertet. Die Score-Funktion Γscore, die wir zur Bewertung neu generierter Peptidkandidaten verwenden, ist gegeben durch:
Der erste Term von Gl. (3), \(\Delta {E}_{{Bindung}}\), erklärt den Unterschied in der Energie des Komplexes und den Energien des Peptids und des Zielbiomoleküls vor der Bindung. Der zweite Term ist der Peptidstabilitätsterm und berücksichtigt die Energie des freien Peptids in der gebundenen Zustandskonfiguration. λ ist ein Gewichtungsfaktor für den Peptidstabilitätsterm mit einem Wert von 0,01. Niedrigere Werte bedeuten bessere Bindemittel. Die Kraftfeldparameter werden dem Kraftfeld Amber 14SB entnommen.
Monte-Carlo-Metropolis-Algorithmus: Der Monte-Carlo-Metropolis-Algorithmus wird verwendet, um neue Testpeptide zu akzeptieren oder abzulehnen.
Weitere Details zum PepBD-Algorithmus und \({\varGamma }_{{score}}\) finden Sie in unserer vorherigen Arbeit26,27,28,29.
Im kanonischen (NVT) Ensemble werden mithilfe des AMBER 18-Pakets explizite lösungsmittelatomistische MD-Simulationen durchgeführt, um die Dynamik des Bindungsprozesses zwischen den Peptidsequenzen und der TcdA-GTD zu untersuchen. Die Startkonfigurationen der Peptid:TcdA-GTD-Komplexe in jeder MD-Simulation sind die Ergebnisse der Suchen im PepBD-Algorithmus. Wir führen für jeden Peptid:TcdA-GTD-Komplex drei unabhängige Simulationen für 100 ns durch, um sicherzustellen, dass das System einen Gleichgewichtszustand erreicht. Jeder Peptid-Rezeptor-Komplex ist in einem periodisch abgeschnittenen oktaedrischen Kasten solvatisiert, der einen 12 Å großen Puffer aus TIP3P-Wasser (\(\sim\) 36.000 Wassermoleküle) enthält, der den Komplex in jede Richtung umgibt. Gegenionen wie Na+ oder Cl- wurden hinzugefügt, um den Peptid:Protein-Komplex vor der Durchführung der MD-Simulationen zu neutralisieren. Es wurden keine zusätzlichen Salzionen hinzugefügt. Der Ansatz der impliziten Lösungsmittelmolekularmechanik/verallgemeinerten Born-Oberfläche (MM/GBSA) mit dem variablen internen Dielektrizitätskonstantenmodell wird verwendet, um die letzten 5 ns-Simulationstrajektorien der Peptid:TcdA-GTD-Komplexe nachzuanalysieren und die freien Bindungsenergien zu berechnen. Einzelheiten zu den Berechnungsverfahren und der Nachanalyse der atomistischen MD-Simulationen finden Sie in unserer früheren Arbeit26,27,28,29,30,31. MD-Simulationsparameter sind in der Ergänzungstabelle 7 beschrieben.
SA1-SA7, NPA (8-mer) und RP (8-mer) wurden auf ChemMatrix Aminomethylharz nach einem GSG-Linker auf einem Biotage Syro I-Peptidsynthesizer (Biotage, Uppsala, Schweden) nach der Fmoc/tBu-Schutzstrategie synthetisiert. Der GSG-Linker hilft bei der Präsentation des Peptids auf der Oberfläche des Harzes. Das Harz wurde 30 Minuten lang in DMF gequollen. Aminosäuren wurden durch Inkubation des Harzes mit 3 Äquivalenten (bezogen auf die funktionelle Dichte des Harzes) geschützter Aminosäure, 3 Äq. HATU und 6 Äq. DIPEA in trockenem DMF für 15 Minuten bei 45 °C. Die Kopplung jeder Aminosäurekopplung wurde durch den Kaiser-Test überwacht. Die Fmoc-Entfernung des Harzes und nach jeder Aminosäurekonjugation wurde unter Verwendung von 5 ml 20 % v/v Piperidin in DMF bei Raumtemperatur für 3 Minuten und dann noch einmal für 10 Minuten durchgeführt. Geschütztes Harz wurde unter Stickstoff bei 4 °C getrocknet gelagert. Das fertige Peptid wurde unmittelbar vor der Verwendung durch Acidolyse entschützt, indem das Harz im Entschützungscocktail, Reagenz K, 82,5 % v/v TFA, 5 % v/v Phenol, 5 % v/v Wasser, 5 % v/v Thioanisol, inkubiert wurde. 2,5 % v/v EDT für 3 Stunden bei Raumtemperatur und unter Mischen. Das entschützte Harz wurde mit DCM, DMF, dann DCM gespült und unter Stickstoff getrocknet.
Peptidsequenzen wurden auf Bindung an TcdA auf einem hauseigenen mikrofluidischen Bead-Imaging-System untersucht, das ursprünglich für die Sortierung von Festphasen-Peptidbibliotheken entwickelt wurde36,38. Der Ausschluss eines fluoreszierenden UDP-Glucose-Cofaktor-Analogs (UDP-Glucose-Fluorescein) aus der UDP-Glucose-Bindungstasche von TcdA wurde als Proxy zur Visualisierung der Peptidbindung an der gewünschten Position verwendet.
Tris-Puffer wurde aus der TcdA-Lösung mit 3-kDa-MWCO-Amicon-Ultra-Zentrifugalfiltern durch 5 Runden 10-facher Konzentration und Verdünnung gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll entfernt. TcdA wurde durch NHS-Chemie mit Alexa Fluor 594 markiert. 1 μl 10 mg/ml NHS-Alexa Fluor 594 wurde zu 100 μl 1 mg/ml TcdA hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation wurde ungebundener Farbstoff mit Pierce Dye Removal Columns gemäß den Anweisungen des Herstellers entfernt. UDP-Glucose-Fluorescein wurde zu 1 mg/ml in PBS, 10 mM Magnesiumchlorid (Bindungspuffer, BB) gelöst.
Das Harz wurde über Nacht mit 0,2 μM fluoreszenzmarkiertem TcdA (TcdA-AF594) inkubiert. Unmittelbar vor dem Screening wurde der Harzlösung 15 Minuten lang UDP-Glucose-Fluorescein in einer Endkonzentration von 0,5 μM zugesetzt. Das Harz wurde viermal vorsichtig mit BB + 0,2 % Tween 20 (Screening Buffer, SB) gewaschen. Harzkügelchen wurden in den roten und grünen Kanälen des zuvor entwickelten Mikrofluidiksystems abgebildet36,38. Die Perlen wurden auf einem motorisierten Trinokular-Inverted-Fluoreszenz-Phasenkontrastmikroskop Olympus IX81 sichtbar gemacht, das mit FITC- und RFA8-Chroma-Filterwürfeln ausgestattet war, und mit einer Hamamatsu C13440-Kamera abgebildet. Jede Harzlösung wurde vor dem Laden auf das Mikrofluidikgerät mit überschüssigem SB verdünnt. Harzkügelchen wurden einzeln durch die Bildgebungskammer geflogen und in den roten (TcdA-AF594) und grünen (UDP-Glucose-Fluorescein) Kanälen abgebildet. Ungefähr 30 einzelne Perlen jeder Peptidsequenz wurden abgebildet.
Die Bildverarbeitung und -analyse wurde an den Rot- und Grünkanalbildern für jede Perle durchgeführt. Da der rote Kanal eine deutliche Halo-Fluoreszenz aufwies, wurde für die Analyse das 90. Perzentil der Pixel in der Perle verwendet. Dadurch wurde die Abweichung aufgrund der Varianz in der Mitte der Perle verringert. Darüber hinaus wurde die für die Inkubation verwendete TcdA-Konzentration zuvor abgestimmt, um eine Reihe von Intensitäten im Halo zu ermöglichen, was eine Unterscheidung zwischen mäßigen und starken Bindemitteln ermöglichte. Die mittlere grüne Fluoreszenz des roten Bereichs des 90. Perzentils und die mittlere grüne Fluoreszenz des 50. Perzentils wurden berechnet, um den UDP-Glucose-Ausschluss aus TcdA zu bestimmen. Der Durchschnitt und die Standardabweichung des 90. Perzentils des roten Kanals und des grünen Kanals wurden berechnet.
SA1–SA4 wurden auf Wang-Harz synthetisiert, das mit der ersten Aminosäure auf einem Initiator+ Alstra (Biotage, Uppsala, Schweden) vorbeladen war, und zwar nach der Fmoc/tBu-Schutzstrategie. Das vorbeladene Wang-Harz wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 ml 5 M Essigsäureanhydrid in 2,5 ml 2 M DIPEA endverschlossen. Aminosäuren wurden durch Inkubation des Harzes mit 5 Äquivalenten (bezogen auf die funktionelle Dichte des Harzes) geschützter Aminosäure, 5 Äq. HATU und 10 Äq. DIPEA in trockenem DMF für 5 Minuten bei 75 °C. Die Kopplung jeder Aminosäurekopplung wurde durch den Kaiser-Test überwacht. Die Fmoc-Entfernung nach jeder Aminosäurekonjugation wurde unter Verwendung von 5 ml 20 % v/v Piperidin in DMF bei Raumtemperatur für 3 Minuten und dann noch einmal für 10 Minuten durchgeführt. Das fertige Peptid wurde gespalten und Seitenkettenschutzgruppen wurden durch Acidolyse entfernt, indem das Harz im Entschützungscocktail, Reagenz K, 82,5 % v/v TFA, 5 % v/v Phenol, 5 % v/v Wasser, 5 % v /v Thioanisol, 2,5 % v/v EDT für 3 Stunden bei Raumtemperatur und unter Mischen. Das im Entschützungscocktail gelöste entschützte Peptid wurde in eiskaltem 50 % Vol./Vol. Ethylether und 50 % Vol./Vol. Petrolether (Etherlösung) ausgefällt. Die Lösung wurde 30 Minuten lang auf −80 °C abgekühlt, pelletiert und dreimal mit eiskalter Etherlösung gewaschen. Das rohe Peptidpellet wurde unter Stickstoff getrocknet, in 50 % Vol./Vol. Acetonitril und 50 % Vol./Vol. Wasser erneut gelöst und vor der Reinigung und Analyse auf dem Biotage V-10 Touch (Biotage, Uppsala, Schweden) getrocknet.
SA1-SA4 wurden mittels Flash-Chromatographie auf einem Isolera Prime (Biotage, Uppsala, Schweden) mit einer Biotage Sfär Bio C18-Säule gereinigt. Rohpeptid wurde in 10 % Vol./Vol. Acetonitril, 90 % Vol./Vol. Wasser und 0,1 % Vol./Vol. Ameisensäure gelöst und auf eine Säulenprobe aufgetragen. Die Umkehrphasenchromatographie wurde mit einem Gradienten von 5 % bis 70 % Acetonitril in Wasser durchgeführt. Als Modifikator wurde 0,1 % Ameisensäure verwendet. Fraktionen wurden über einem Absorptionsschwellenwert von 220 nm und 280 nm gesammelt. Die Fraktionen wurden mittels LC-MS analysiert, um das gewünschte Peptid zu identifizieren und zu quantifizieren. Gereinigte Peptidfraktionen wurden lyophilisiert. Zum abschließenden Polieren wurden die Peptide in 50 % v/v Wasser und 50 % v/v Acetonitril gelöst, filtersterilisiert, aliquotiert und lyophilisiert.
Spenderauswahl: Menschliche Spenderdärme in Transplantationsqualität wurden von HonorBridge (Durham, NC) bezogen und vom UNC Office of Human Research Ethics von der Forschung am Menschen ausgenommen. Die Kriterien für die Spenderakzeptanz waren wie folgt: Alter 65 Jahre oder jünger, nur hirntot, negativ auf das humane Immundefizienzvirus, Hepatitis, Syphilis, Tuberkulose oder COVID-19 sowie keine Vorgeschichte schwerer Bauchverletzungen, Darmoperationen oder Krebs oder Chemotherapie. Für alle Studien wurde Dickdarmgewebe eines 34-jährigen hispanischen Mannes verwendet. Kolon-ISCs dieses Spenders wurden aus Primärgeweben isoliert. Chirurgische Proben des menschlichen Dickdarms wurden von Spendern bei HonorBridge (Durham, NC) entnommen. Krypten aus dem Dickdarm wurden aus der Probe durch Inkubation in einem Chelatpuffer für 75 Minuten bei 20 °C und anschließendes kräftiges Schütteln in einem konischen 50-ml-Röhrchen entfernt. Der Chelatpuffer bestand aus EDTA (2 mM), Dithiothreitol (DTT, 0,5 mM, frisch hinzugefügt), Na2HPO4 (5,6 mM), KH2PO4 (8,0 mM), NaCl (96,2 mM), KCl (1,6 mM), Saccharose (43,4 mM). mM), D-Sorbitol (54,9 mM), pH 7,4. Freigesetzte Krypten wurden als Monoschicht auf neutralisierten Kollagenhydrogelen expandiert. Krypten wurden auf die Oberseite von 1 mg/ml Kollagenhydrogelen (1 ml in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte) mit einer Dichte von 10.000 Krypten/Vertiefung gelegt und mit 3 ml Expansionsmedium (EM)61 mit 10 mmol/l überschichtet Y-27632 (S1049; SelleckChem, Houston, TX) und bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert. EM wurde verwendet, um die Anzahl der Epithelzellen als Monoschichten zu erweitern; Das Medium wurde am Tag nach der Aussaat und danach alle 48 Stunden gewechselt. Wenn die Zellbedeckung mehr als 80 % betrug (typischerweise 4 bis 6 Tage), wurde das Epithel in Fragmente dissoziiert62, um sie entweder auf Gewebekulturplatten mit 6 Vertiefungen, die zur weiteren Expansion mit Kollagenhydrogelen beschichtet waren, oder auf Transwell-Einsätze mit 12 Vertiefungen auszusäen ( 3460; Corning, Corning, NY) beschichtet mit 1 % Matrigel für Experimente61. Um differenzierte Enterozyten für die Toxizitätstests zu erzeugen, wurden 2 Vertiefungen einer 6-Well-Kolon-ISC-Expansionsplatte, in der die Zellen zu etwa 90 % konfluent waren, wie oben beschrieben dissoziiert61 und auf 12-Well-Transwell-Einsätzen plattiert, die mit 1 % Matrigel beschichtet waren. Kolonische ISCs wurden in Kolonexpansionsmedien (EM, siehe Lit. 61 für alle Medienformulierungen) expandiert, bis sie konfluent waren (~4 Tage). Nachdem die ISCs im Dickdarm konfluent waren, wurde das Medium auf Differenzierungsmedium (DM) umgestellt und der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) wurde alle 24 Stunden mit dem EVOM2 (World Precision Instruments, FL) gemessen. Nach 3–4 Tagen der Differenzierung, als der TEER > 1000 Ohm/cm2 betrug, wurden die Toxizitätstests eingeleitet. Alle Zellen wurden bei 37 °C in einer feuchten Umgebung mit 5 % CO2 inkubiert.
Die Peptide wurden in einer Konzentration von 1,0 mM in 500 µl DM verdünnt und dem apikalen Reservoir zugesetzt. Die Peptide durften vor der Zugabe von TcdA (SML1154; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zwei Stunden lang mit den Kolon-Monoschichten vorinkubieren. TcdA mit einer Endkonzentration von 30 pMol wurde direkt dem apikalen Reservoirmedium, das das Peptid enthielt, zugesetzt und bei 37 °C in einer feuchten Umgebung mit 5 % CO2 inkubiert. TEER wurde vor und nach der Anwendung der Peptide gemessen. Anschließend wurde der TEER zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen.
Das modifizierte Peptid SA1-K-Amid wurde synthetisiert, um die Pfropfung auf Goldsensoren über den C-terminalen Lysinrest zu erleichtern. Die Amidfunktionalisierung des C-Terminus verhinderte die elektrostatische Abstoßung zwischen dem C-Terminus des Peptids und Carbonsäuregruppen auf dem SAM. SA1-K-Amid wurde auf Rink-Amid-Harz auf einem Initiator+ Alstra (Biotage, Uppsala, Schweden) nach der oben beschriebenen Fmoc/tBu-Schutzstrategie synthetisiert. Ein modifizierter Entschützungscocktail, 91,5 Gew.-% TFA, 2,5 Gew.-% Wasser, 2,5 Gew.-% TIS, 2,5 Gew.-% DTT und 1 Gew.-% Indol, wurde verwendet. SA1-K-Amid wurde nach dem oben beschriebenen Protokoll gesammelt, gereinigt und analysiert.
Gold-Sensorobjektträger (12 × 20 × 0,5 mm3), 50-nm-Gold, geklebt auf Glassensoren mit 2 nm Chrom, wurden vor der Verwendung durch Einweichen in Piranha-Lösung (98 % H2SO4 und 30 % H2O2 bei 3:1 v/v) gereinigt. für 15–20 Minuten, gefolgt von gründlichem Spülen in MQ-Wasser, Spülen in 200-prozentigem Ethanol und Trocknen unter einem Stickstoffstrom. Die Goldsensorobjektträger wurden vor der Modifikation kurz in 200-prozentiges Ethanol eingetaucht. (Warnung: Piranha-Lösung reagiert heftig mit organischen Materialien und sollte mit äußerster Vorsicht gehandhabt werden.)
Eine gemischte Thiol-SAM wurde durch Auflösen von HSC11(EG)3OH und HSC11(EG)6OCH2COOH im Molverhältnis 3:1, 1 mM Gesamtkonzentration, in 200-prozentigem Ethanol hergestellt. Die Goldsensoren wurden unter Stickstoff in die Thiollösung getaucht und 24 Stunden lang vor Licht geschützt. Die Oberflächen wurden kräftig mit 200-prozentigem Ethanol gespült, um die Multischichten aufzubrechen, und dann unter Stickstoff für die anschließende Charakterisierung, Peptidpfropfung oder SPR-Experimente getrocknet. Das modifizierte Peptid SA1-K-Amid wurde durch NHS/EDC-Chemie auf Carbonsäuregruppen auf dem SAM gepfropft. 200 mM EDC und 50 mM NHS, gelöst in MQ-Wasser, wurden 1 Stunde lang auf die Oberflächen des Goldsensors aufgetragen. Die aktivierten Goldsensoren wurden in MQ-Wasser gespült und unter Stickstoff getrocknet. 1 mg/ml Peptid SA1-K-amid wurde in MQ-Wasser gelöst und 1 Stunde lang an die aktivierten Goldsensoren konjugiert. Die mit Peptiden gepfropften Goldsensoren wurden in MQ-Wasser gespült und unter Stickstoff getrocknet. Verbleibende aktivierte Carbonsäurestellen wurden durch 30-minütige Inkubation von 3 M Ethanolamin in MQ-Wasser auf der Oberfläche der Goldsensoren blockiert. Die Goldsensoren wurden für die anschließende Charakterisierung und SPR-Experimente in MQ-Wasser gespült und unter Stickstoff getrocknet.
Die Oberflächendicke des gemischten Thiol-SAM und des SAM mit gepfropftem Peptid SA1 wurde unter Verwendung eines spektroskopischen Ellipsometers M-2000 DI (JA Woollam, Lincoln, NE) bei drei Einfallswinkeln Φ = 55°, 65°, 75° gemessen. Von unten nach oben wurden die Proben als 3-mm-Cauchy-Substrat (Glas), 2-nm-Chrom und 50-nm-Gold gemäß den Herstellerangaben modelliert. Der Anfangswert des Cauchy-Substrats (Polymerschicht) auf der Goldoberfläche wurde auf 25 nm geschätzt und die Oberflächendicke wurde nach der Modellerstellung gemessen. Absorptionsstörungen wurden durch die Verdichtung des Wellenlängenbereichs von 600–1000 nm gemildert.
Flugzeit-Sekundärionenmassenspektrometrie (ToF-SIMS)-Charakterisierung von Gold-Sensorobjektträgern mit selbstorganisierten Monoschichten (SAMs) und kovalent an SAM gepfropftem SA1. Die Experimente wurden mit einem TOF SIMS V-Instrument (ION TOF, Inc., Chestnut Ridge, NY) durchgeführt. Für SAM und SAM-SA1 mit gemischtem Thiol wurden positive und negative Spektren aufgezeichnet. Die positiven Sekundärionen-Massenspektren wurden mit H+, C+, C2H3+, C3H5+ und C4H7+ kalibriert. Die negativen Sekundärionen-Massenspektren wurden mit C-, O-, OH- bzw. Cn- kalibriert.
Ein KSV SPR 200-Instrument (BioNavis Instruments, Helsinki, Finnland) wurde verwendet, um Änderungen im Brechungsindex an der Sensorschnittstelle zu erkennen. Die Sensoren wurden mit 30 μl/min 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 (Laufpuffer, RB) für mehr als 5 Minuten äquilibriert. Nachdem eine stabile Grundlinie etabliert war, wurden 250 μl TcdA in RB in verschiedenen Konzentrationen mit 30 μl/min injiziert, gefolgt von RB. Aufgrund der Schwierigkeit, die Bindungsinteraktion zwischen Peptid und TcdA zu unterbrechen, wurden für jede Messung neue Sensoren verwendet.
Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD wurde durch Messung der Gleichgewichtsnettoänderung des SPR-Signals (Grad) nach jeder Injektion von TcdA bei Konzentrationen von etwa 0,1 KD bis 10 KD ermittelt. Die Nettoänderung in Grad wurde über einen zuvor gemessenen Umrechnungsfaktor, 1 Grad Reaktion = 7,31 mg/m2, in die pro Flächeneinheit adsorbierte Proteinmasse umgerechnet. Die Daten wurden an eine Langmuir-Isotherme angepasst, wobei die adsorbierte Masse pro Flächeneinheit, Q (nmol/m2), und die TcdA-Konzentration der Lösung, [TcdA] (nM), verwendet wurden.
wobei KD die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (nM) und Qmax die maximale Bindungskapazität (nmol/m2) ist. Ein Langmuir-Modell ist geeignet, wenn zwischen Ligand und Analyt eine 1:1-Wechselwirkung besteht, es keine Stofftransferbeschränkungen gibt und die Bindungsereignisse unabhängig sind. Unter der Annahme einer reversiblen Bindung,
Dabei ist ka die Assoziationskonstante (Adsorption) zweiter Ordnung und kd die Dissoziationskonstante (Desorption) erster Ordnung. Unter der Annahme, dass es keine Stofftransportbeschränkungen gibt, ist die Konzentration von TcdA in der Masse und an der Oberfläche gleich. Die SPR-Reaktion und die adsorbierte Menge Q sind proportional zur Konzentration des an das Peptid gebundenen TcdA, [TcdA·SA1]. Die maximale SPR-Antwort und die maximale Bindungskapazität, Qmax, sind proportional zum maximal gebundenen Liganden [TcdA]tot. Setzt man diese in die Geschwindigkeitsgleichung ein, erhält man:
Integrieren von Gl. 6 und Ersetzen von kd,
Der erste Term in Gl. 7 bestimmt das Gleichgewichtsniveau und der zweite Term bestimmt die Zeit bis zum Erreichen des Gleichgewichts. Die Dissoziationskonstante kann aus KD und ka bestimmt werden.
Einzelheiten zu den Experimenten finden Sie im Haupttext und unter „Methoden“. Für den Bead-basierten Assay wurden statistische Analysen unter Verwendung eines zweiseitigen T-Tests in Verbindung mit der RP(-T)-Kontrolle durchgeführt. Die Signifikanz wurde bei p < 0,05 bestimmt. Die Anzahl der Wiederholungen für jede Probe war wie folgt: SA1 (23), SA2 (20), SA3 (25), SA4 (19), SA5 (23), SA6 (21), SA7 (15), NPA (36). , RP (14), RP (-T) (8) und RP (-T -U) (7). Für jede Probe wurden etwa 40 Perlen abgebildet, wobei Bilder, die unscharfe Perlen oder Perlenaggregate enthielten, ausgeschlossen wurden. Für den SPR-Assay handelte es sich bei den gesammelten Daten im Allgemeinen um Einzelmessungen, mit Ausnahme von zwei Bedingungen (10 nM, n = 2; 25 nM, n = 3). Jeder SPR-Sensor wurde verwendet, um zwei Proben über zwei separate Kanäle laufen zu lassen, was zu insgesamt 14 Messungen führte. Allerdings wurde eine Messung aufgrund des Verlusts eines stabilen Signals ausgeschlossen. Die Messungen wurden über zwei Sitzungen durchgeführt und eine Bedingung (25 nM TcdA) wurde in beiden Sitzungen als Kontrolle wiederholt.
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.
Daten sind im Manuskript und/oder in unterstützenden Informationen verfügbar. Amber-Topologiedatei und endgültige PDB-Datei jedes MD-Simulationslaufs von SA1-SA7, Rohdatendateien zur Reproduktion von Diagrammen sind verfügbar unter: https://github.com/CarolHall-NCSU-CBE/8-mer-peptides-TcdA.
Der PepBD-Code und der Matlab-Code für die Bildverarbeitung im Bead-Assay sind verfügbar unter: https://github.com/CarolHall-NCSU-CBE/8-mer-peptides-TcdA.
McDonald, EG & Lee, TC Clostridium difficile-Infektion. N. engl. J. Med. 373, 286–288 (2015).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Czepiel, J. et al. Clostridium-difficile-Infektion: Übersicht. EUR. J. Clin. Mikrobiol. Infizieren. Dis. 38, 1211–1221 (2019).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Centers for Disease Control and Prevention: Fast eine halbe Million Amerikaner litten in einem einzigen Jahr an Infektionen mit Clostridium difficile. Letzte Überprüfung der Seite: 22. März 2017 (archiviertes Dokument); Verfügbar unter: https://www.cdc.gov/media/releases/2015/p0225-clostridium-difficile.html.
Balsells, E. et al. Globale Belastung durch Clostridium-difficile-Infektionen: Eine systematische Überprüfung und Metaanalyse. J. Glob. Gesundheit 9, 010407 (2019).
Artikel PubMed Google Scholar
Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten, Clostridioides-difficile-Infektion. Letzte Überprüfung der Seite: 13. November 2019; Verfügbar unter: https://www.cdc.gov/hai/organisms/cdiff/cdiff_infect.html.
Lessa, FC et al. Belastung durch Clostridium difficile-Infektion in den Vereinigten Staaten. N. engl. J. Med. 372, 825–834 (2015).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Napolitano, LM & Edminstion, CE Clostridium difficile-Krankheit: Diagnose, Pathogenese und Behandlungsaktualisierung. Operation. 162, 325–348 (2017).
Artikel PubMed Google Scholar
Rupnik, M., Wilcox, MH & Gerding, DN Clostridium difficile-Infektion: neue Entwicklungen in Epidemiologie und Pathogenese. Nat. Rev. Microbiol. 7, 526–536 (2009).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Aktories, K., Schwan, C. & Jank, T. Clostridium difficile Toxinbiologie. Annu. Rev. Microbiol. 71, 281–307 (2017).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Abt, MC, McKenney, PT & Pamer, EG Clostridium difficile Colitis: Pathogenese und Wirtsabwehr. Nat. Rev. Microbiol. 14, 609–620 (2016).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Bradshaw, WJ, Roberts, AK, Shone, CC & Acharya, KR Die Struktur der S-Schicht von Clostridium difficile. J. Zelle. Komm. Signal. 12, 319–331 (2018).
Artikel PubMed Google Scholar
Fagan, RP et al. Strukturelle Einblicke in die molekulare Organisation der S-Schicht von Clostridium difficile. Mol. Microbiol 71, 1308–1322 (2009).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Ho, JGS, Greco, A., Rupnik, M. & Ng, KKS Kristallstruktur rezeptorbindender C-terminaler Wiederholungen aus Clostridium difficile-Toxin A. Proc. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 102, 18373–18378 (2005).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Murase, T. et al. Strukturelle Grundlage für die Antikörpererkennung in den Rezeptorbindungsdomänen der Toxine a und B aus Clostridium difficile. J. of Biol. Chem. 289, 2331–2343 (2014).
Artikel CAS Google Scholar
Tao, L. et al. Sulfatierte Glykosaminoglykane und Low-Density-Lipoprotein-Rezeptoren tragen zum Eintritt des Clostridium-difficile-Toxins A in die Zellen bei. Nat. Mikrobiol. 4, 1760–1769 (2019).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Ziegler, MOP, Jank, T., Aktories, K. & Schulz, GE Konformationsänderungen und Reaktion von clostridialen glykosylierenden Toxinen. J. Mol. Biol. 377, 1346–1356 (2008).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Chen, P. et al. Struktur des Clostridium difficile-Toxins voller Länge B. Nat. Struktur. Mol. Biol. 26, 712–719 (2019).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Lyras, D. et al. Toxin B ist für die Virulenz von Clostridium difficile essentiell. Natur. 458, 1176–1179 (2009).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Kühne, SA et al. Die Rolle von Toxin A und Toxin B bei einer Clostridium-difficile-Infektion. Natur. 467, 711–713 (2010).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Slimings, C. & Riley, TV-Antibiotika und im Krankenhaus erworbene Clostridium-difficile-Infektion: Aktualisierung der systematischen Überprüfung und Metaanalyse. J. von Antimicrob. Chemother 69, 881–891 (2014).
Artikel CAS Google Scholar
Lewis, BB et al. Verlust der Mikrobiota-vermittelten Kolonisierungsresistenz gegen eine Clostridium-difficile-Infektion mit oralem Vancomycin im Vergleich zu Metronidazol. J. Infizieren. Dis. 212, 1656–1665 (2015).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Lee, Y. et al. Bezlotoxumab (Zinplava) gegen Clostridium-difficile-Infektion: der erste zugelassene monoklonale Antikörper, um das Wiederauftreten einer bakteriellen Infektion zu verhindern. PT 42, 735–738 (2017).
PubMed PubMed Central Google Scholar
Kinoshita, K. Präklinische und klinische Eigenschaften von Bezlotoxumab (ZINPLAVA® 25 mg/ml Konzentrat zur Herstellung einer Infusionslösung), neuartiges Therapeutikum für Clostridium-difficile-Infektionen. Folia Pharmacol. Jpn. 152, 39–50 (2018).
Artikel CAS Google Scholar
Kelly, BJ & Tebas, P. Überprüfung der klinischen Praxis und Infrastruktur der fäkalen Mikrobiota-Transplantation bei Clostridium-difficile-Infektionen. Brust. 153, 266–277 (2018).
Artikel PubMed Google Scholar
DeFillip, Z. et al. Arzneimittelresistente E. coli-Bakteriämie, übertragen durch fäkale Mikrobiota-Transplantation. N. engl. J. Med. 381, 2043–2050 (2019).
Artikel Google Scholar
Xiao, J. Biomol. Struktur. und Dyn. 32, 1523–1536 (2014).
Artikel CAS Google Scholar
Xiao, J. Comp. Chem. 37, 2423–2435 (2016).
Artikel CAS Google Scholar
Xiao, Proteine: Struktur. Funktion. Genet 84, 700–711 (2016).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Xiao, J. Chem. Theorieberechnung. 13, 5709–5720 (2017).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Spears, JL, Xiao, X., Hall, CK & Agris, PF Die Aminosäuresignatur ermöglicht es Proteinen, modifizierte tRNA zu erkennen. Biochemie. 53, 1125–1133 (2014).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Xiao, X. et al. Weiterentwicklung peptidbasierter Bioerkennungselemente für Biosensoren mithilfe der In-silico-Evolution. ACS Sensors 3, 1024–1031 (2018).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Xiao, X. et al. In-silico-Entdeckung und Validierung von Neuropeptid-y-bindenden Peptiden für Sensoren. J. Phys. Chem. B. 124, 61–68 (2020).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Xiao, X. et al. Neuartige Peptidliganden für die Antikörperreinigung sorgen für eine überlegene Beseitigung von Proteinverunreinigungen der Wirtszelle. J. Chromatogr. A. 1625, 461237 (2020).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Xiao, X. et al. De-novo-Entdeckung peptidbasierter Affinitätsliganden für das Fab-Fragment des menschlichen Immunglobulins GJ Chromatogr. A. 1669, 462941 (2022).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Sarma, S., Herrera, SM, Xiao, J. Phys. Chem. B. 126, 8129–8139 (2022).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Day, K. et al. Entdeckung und Bewertung von Peptidliganden für die selektive Adsorption und Freisetzung von Cas9-Nuklease auf festen Substraten. Bioconjugate Chem 30, 3057–3068 (2019).
Artikel CAS Google Scholar
Prodromou, R. et al. Entwicklung zyklischer Peptidliganden der nächsten Generation für die lichtgesteuerte Aufnahme und Freisetzung therapeutischer Proteine. Adv. Funktion. Mater. 31, 2101410 (2021).
Artikel CAS Google Scholar
Saberi-Bosari, S. et al. Erschwingliche mikrofluidische Perlensortierplattform für die automatisierte Auswahl poröser Partikel, die mit bioaktiven Verbindungen funktionalisiert sind. Wissenschaftliche Berichte 9, 7210 (2019).
Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar
Xiao, X. et al. In Silico-Identifizierung und experimentelle Validierung peptidbasierter Inhibitoren gegen Clostridium difficile-Toxin A. ACS Chem. Biol. 17, 118–128 (2022).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Abdeen, SJ, Swett, RJ & Feig, AL Peptidinhibitoren gegen die Toxine A und B von Clostridium difficile. ACS Chem. Biol. 5, 1097–1103 (2010).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Chumbler, NC et al. Kristallstruktur des Clostridium diffiicile-Toxins A. Nat. Mikrobiol. 15002, 1–6 (2016).
Google Scholar
Burclaff, J. et al. Eine proximal-distale Untersuchung des Dünndarm- und Dickdarmepithels eines gesunden erwachsenen Menschen mittels Einzelzell-Transkriptomik. Zellmol. Gastroenterol. Hepatol. 13, 1544–1589 (2022).
Google Scholar
Xiao, Protein Sci 25, 2243–2255 (2016).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Loughney, JW et al. Entwicklung eines nicht radioaktiv markierten Glucosyltransferase-Aktivitätstests für C. difficile-Toxin A und B mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie. J. Chromatogr. A. 1498, 169–175 (2017).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Ciesla, WP & Bobak, DA Clostridium difficile-Toxine A und B sind kationenabhängige UDP-Glucose-Hydrolasen mit unterschiedlichen katalytischen Aktivitäten. J. Biol. Chem. 273, 16021–16026 (1998).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Laughlin, MR, Petit, WA, Dizon, JM, Shulman, RG & Barrett, EJ NMR-Messungen des myokardialen Glykogenstoffwechsels in vivo. J. Biol. Chem 263, 2285–2291 (1988).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Bhattacharyya, S., Kerzmann, A. & Feig, AL Fluoreszierende Analoga von UDP-Glucose und ihre Verwendung bei der Charakterisierung der Substratbindung durch Toxin A aus Clostridium difficile. EUR. J. Biochem 269, 3425–3432 (2002).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Gunasekara, DB et al. Eine Monoschicht aus primärem Kolonepithel, die auf einem Gerüst mit einem Steifigkeitsgradienten für Arzneimitteltransportstudien erzeugt wird. Anal. Chem. 90, 13331–13340 (2018).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Wang, Y. et al. Selbsterneuernde Monoschicht aus primären Kolon- oder Rektumepithelzellen. Zelle. Mol. Gastroenterol. Hepatol. 4, 165–182 (2017).
Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar
Gomez-Martinez, I. et al. Ein planares Kulturmodell menschlicher absorbierender Enterozyten zeigt, dass Metformin die Oxidation und den Export von Fettsäuren erhöht. Zelle. Mol. Gastroenterol. Hepatol. 14, 409–434 (2022).
Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar
Song, L. et al. Entwicklung und Validierung digitaler enzymgebundener Immunosorbens-Assays für den ultraempfindlichen Nachweis und die Quantifizierung von Clostridium-difficile-Toxinen im Stuhl. J. Clin. Mikrobiol. 53, 3204–3212 (2015).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Islam, N., Shen, F., Gurgel, PV, Rojas, OJ & Carbonell, RG Dynamische und Gleichgewichtsleistung von Sensoren basierend auf kurzen Peptidliganden für die Affinitätsadsorption von menschlichem IgG unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz. Biosens. Bioelektron. 58, 380–387 (2014).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Wang, Y. et al. Auf PD-1 ausgerichtete Entdeckung von Peptidinhibitoren durch virtuelles Screening, Molekulardynamiksimulation und Oberflächenplasmonenresonanz. Moleküle. 24, 3784 (2019).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Ershov, PV et al. Kinetische und thermodynamische Analyse von Dimerisierungsinhibitoren, die durch Oberflächenplasmonresonanz an HIV-Proteasemonomere binden. Biochem. (Mosk.) Suppl. B: Biomed. Chem. 6, 94–97 (2012).
Artikel Google Scholar
Weiger, MC et al. Quantifizierung der Bindungsaffinität eines spezifischen Hydroxylapatit-bindenden Peptids. Biomaterialien. 31, 2955–2963 (2010).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Weiss, E. et al. Bestimmung kinetischer Konstanten für die Wechselwirkung zwischen einem monoklonalen Antikörper und Peptiden mittels Oberflächenplasmonresonanz. Biochemie. 31, 6298–6304 (1992).
Artikel PubMed Google Scholar
Morelock, MM, Ingraham, RH, Betageri, R. & Jakes, S. Bestimmung der Rezeptor-Ligand-Kinetik und der Gleichgewichtsbindungskonstanten mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz: Anwendung auf die lck-SH2-Domäne und Phosphotyrosylpeptide. J. Med. Chem. 38, 1309–1318 (1995).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Lin, S., Shih-Yuan Lee, A., Lin, CC & Lee, CK Bestimmung der Bindungskonstante und Stöchiometrie für die Antikörper-Antigen-Wechselwirkung mit Oberflächenplasmonresonanz. Curr. Proteom. 3, 271–282 (2007).
Artikel CAS Google Scholar
Tam, J. et al. Kleinmolekulare Inhibitoren von Clostridium difficile-Toxin B-induzierten Zellschäden. Chem. Biol. 22, 175–185 (2015).
Artikel CAS PubMed Google Scholar
Paparella, AS et al. Hemmung der TcdA- und TcdB-Toxine von Clostridium difficile mit Übergangszustandsanaloga. Nat. Komm. 12, 6285 (2021).
Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Ok, MT et al. Ein Leaky-Colon-Modell zeigt eine entkoppelte apikale/basale Zytotoxizität bei früher Clostridioides-difficile-Toxin-Exposition. Bin. J. Physiol. Magen-Darm-Test. 324, 262–280 (2023).
Artikel Google Scholar
Breau, KA et al. Effiziente Transgenese und homologiegesteuertes Gen-Targeting in Monoschichten primärer menschlicher Dünndarm- und Dickdarmepithelstammzellen. Stem Cell Rep. 17, 1493–1506 (2022).
Artikel CAS Google Scholar
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Diese Forschung wurde durch Mittel der National Science Foundation (CBET-1934284), der National Institutes of Health (R01DK109559), des North Carolina Biotechnology Center (2019-FLG-3841) und des UNC Center for Gastrointestinal Biology and Disease, P30DK034987, unterstützt und von der Novo Nordisk Foundation (AIM-Bio), NNF19SA0035474. Diese Arbeit nutzte das Extreme Science and Engineering Discovery Environment (XSEDE), unterstützt von der National Science Foundation (ACI-1548562). S. Sarma, X. Xiao und CK Hall danken dem San Diego Supercomputer Center (SDSC) für die Rechenzeit.
Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sudeep Sarma, Carly M. Catella.
Fakultät für Chemieingenieurwesen, North Carolina State University, Raleigh, NC, 27695-7905, USA
Sudeep Sarma, Carly M. Catella, Xingqing Xiao, Deniz Durmusoglu, Stefano Menegatti, Nathan Crook und Carol K. Hall
Medizinische Fakultät, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, 27514, USA
Ellyce T. San Pedro und Scott T. Magness
Biomanufacturing Training and Education Center (BTEC), North Carolina State University, Raleigh, NC, 27695, USA
Stefano Menegatti
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SS, CMC, XX, DD, SM, NC, STM und CKH haben Forschung entworfen, SS, CMC und ESP haben Forschung durchgeführt, SS, CMC, ESP, SM, NC, STM und CKH haben Daten analysiert, SS, CMC, ESP, SM, NC, STM und CKH haben den Artikel geschrieben.
Korrespondenz mit Carol K. Hall.
SS, CMC, XX, SM, NC, STM und CKH haben ein konkurrierendes Interesse. SS, CMC, XX, SM, NC, STM und CKH haben für diese Arbeit einen Patentantrag eingereicht. ESP und DD haben keine konkurrierenden Interessen.
Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong.
Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Sarma, S., Catella, CM, San Pedro, ET et al. Design von 8-mer-Peptiden, die Clostridioides difficile-Toxin A in Darmzellen blockieren. Commun Biol 6, 878 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05242-x
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Eingegangen: 17. März 2023
Angenommen: 14. August 2023
Veröffentlicht: 26. August 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05242-x
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