Einfluss linear polarisierter Mikrowellen auf die Nanomorphologie der Calciumcarbonat-Mineralisierung unter Verwendung von Peptiden

Jul 07, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12027 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mikrowellen werden für vielfältige Anwendungen wie Mobiltelefone, Öfen und Therapiegeräte eingesetzt. Allerdings gibt es nur wenige Berichte über die Auswirkungen von Mikrowellen auf andere Krankheiten als Krebs und auf physiologische Prozesse. Hier konzentrierten wir uns auf die CaCO3-Mineralisierung als Modell der Biomineralisierung und versuchten, die Wirkung von Mikrowellen auf die CaCO3-Mineralisierung mithilfe von Peptiden aufzuklären. Wir führten AFM-, ζ-Potenzial-, HPLC-, ICP-AES- und relative Permittivitätsmessungen durch. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Mikrowellen die Nanomorphologie des CaCO3-Niederschlags verändern, von kugelförmigen Partikeln zu fadenförmigen Strukturen. Darüber hinaus haben Mikrowellen nur einen geringen Einfluss auf die Mineralisierung, wenn die Mineralisierungsfähigkeit eines Peptids hoch ist, aber eine große Wirkung, wenn die Fällungsfähigkeit niedrig ist. Unsere Erkenntnisse könnten nicht nur auf die Behandlung von Zähnen und Knochen anwendbar sein, sondern auch auf die Entwicklung organisch-anorganischer Nanobiomaterialien. Diese Methodik kann auf andere molekulare/atomare Reaktionen unter verschiedenen Mikrowellenbedingungen ausgeweitet werden, um Reaktionsaktivitätsparameter zu ändern.

Mikrowellen (MWs) werden für verschiedene Anwendungen wie Mobiltelefone, MW-Öfen und MW-Therapiegeräte verwendet. Allerdings unterliegen die von diesen Geräten erzeugten MWs internationalen Vorschriften, da Bedenken hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf den menschlichen Körper bestehen. Beispielsweise gibt es mehrere Berichte, dass Menschen, die über einen langen Zeitraum MWs ausgesetzt sind, eine hohe Prävalenz von Krebs haben1, und dass Menschen, die häufig Mobiltelefone nutzen, eine hohe Prävalenz von Hirntumoren haben2. Andererseits zeigte ein Bericht, der 219 epidemiologische Forschungsarbeiten zu den Auswirkungen von Hirntumoren bei jungen Menschen zusammenfasst, keinen Anstieg der Morbidität aufgrund der MW-Exposition infolge der Nutzung von Mobiltelefonen3. MWs verfügen über eine hohe Biopermeabilität und Heizkapazität und werden daher für orthopädische Wärmeprodukte und die Behandlung von Leberkrebs verwendet4. MWs werden auch bei der Synthese organischer Materialien5,6,7,8, anorganischer Materialien9,10,11,12 und Peptide13,14 verwendet. Allerdings gibt es im Bereich der Biowissenschaften nur wenige Forschungsberichte über die Auswirkungen von MWs auf andere Krankheiten als Krebs oder auf die Physiologie. Krankheiten und Physiologie beeinflussen die Reaktionen von Zellen aufgrund komplexer Wechselwirkungen von Biomolekülen wie Proteinen und Peptiden. Daher erfordert das Verhalten verschiedener Moleküle unter MW-Bestrahlung eine detaillierte Analyse, um die Auswirkungen von MWs auf Krankheiten und biologische Funktionen aufzuklären. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Mineralisierung von Calciumcarbonat (CaCO3) als biologische Modellreaktion15,16,17,18,19,20,21,22,23, den Prozess, durch den die Exoskelette von Krebstieren, Zähnen und Knochen gebildet werden . Unter Biomineralisierung versteht man die Ausfällung anorganischer Stoffe durch Biomoleküle wie Proteine ​​und Peptide24. Wir haben uns zuvor auf die CaCO3-Ausfällung mithilfe von Peptiden konzentriert und versucht, Aspekte des Mechanismus aufzuklären, der der Biomineralisierung zugrunde liegt, indem wir den N-Terminus in der Kernsequenz von Calciumcarbonat (CaCO3) ausfällenden Peptiden (CAP-1-Sequenz, ein Teil des Flusskrebs-Exoskeletts) modifiziert haben15 . Die Untersuchung der Wirkung von MWs auf die CaCO3-Biomineralisierung mithilfe von Peptiden würde dazu beitragen, das Verhalten sowohl organischer als auch anorganischer Moleküle aufzuklären und Hinweise auf die Wirkung von MWs auf biologische Prozesse zu liefern. Wir haben einen Halbleitersender (Minato Medical Science Co., Ltd.) zur Erzeugung linear polarisierter (gerichteter) MWs vorbereitet und die Korrelation zwischen der MW-Ausgangsleistung und Morphologie, ζ-Potenzial, Niederschlag, Peptidverbrauch usw. bei der Mineralisierung unter Verwendung von Peptiden analysiert . Diese Experimente werden ein detaillierteres Verständnis der Beziehung zwischen MW-Parametern und Biomineralisierungsparametern liefern, was nicht nur auf die Behandlung von Zähnen und Knochen, sondern auch auf die Entwicklung anorganischer Nanomaterialien anwendbar sein wird. Darüber hinaus liefert diese Studie Einblicke in die Auswirkungen von MWs auf andere Moleküle, und diese Effekte könnten durch die Änderung von MW-Parametern wie Strahlungspolarisation und Ausgangsleistung kontrolliert werden.

Zuerst haben wir die Peptide für diese Studie ausgewählt. Wir haben zuvor die Auswirkungen der CaCO3-Mineralisierung im Detail analysiert, indem wir vier Peptide mit unterschiedlichen negativen Nettoladungen verwendet haben, indem wir den N-Terminus in der Kernsequenz der CaCO3-ausfällenden Peptide (CAP-1-Sequenz, ein Teil des Flusskrebs-Exoskeletts) modifiziert haben15,23 (Abb . 1). Kurz gesagt, wir haben die Kernsequenzen durch N-Terminus-Phosphorylierung und/oder N-Terminus-Acetylierung modifiziert oder den N-Terminus unverändert gelassen. Wir haben die Veränderung der CaCO3-Fällungsfähigkeit jedes Peptids mithilfe der induktiv gekoppelten Plasma-Atomemissionsspektroskopie (ICP-AES) geschätzt. Diese Peptide zeigten unterschiedliche Fähigkeiten zur CaCO3-Fällung (Abb. S1). Die Reihenfolge der höheren Fällungsfähigkeit war Ac-S-Peptid ≈ > Ac-pS-Peptid > pS-Peptid > S-Peptid.

Peptidsequenzen und -strukturen. Sequenzen der CaCO3-ausfällenden Peptide, (a) S-Peptid, (b) Ac-S-Peptid, (c) pS-Peptid und (d) Ac-pS-Peptid, die in dieser Studie verwendet wurden.

Als MW-Quelle wurde ein Halbleitersender verwendet und eine linear polarisierte Antenne platziert, um MWs von unterhalb der Probe abzustrahlen (Abb. 2a). Allgemeine MW-Geräte wie MW-Öfen und medizinische MW-Therapiegeräte erzeugen MWs mithilfe eines Magnetrons. Vom Magnetron oszillierte MWs haben ein breites Frequenzband. Darüber hinaus kann die Mittenfrequenz der Schwingung schwanken, wenn der Ausgang analog gesteuert wird. Hier haben wir einen Halbleiter-MW-Generator hergestellt, der aus einem digitalen frequenzgesteuerten Oszillator und einem Halbleiterverstärker besteht, um die Auswirkungen von Schwankungsfaktoren wie der Frequenz zu minimieren. Darüber hinaus wird die Ausgangsenergie durch einen Leistungsregler gesteuert, indem die Eigenschaften des Halbleiters ausgenutzt werden. Dieses MW-Bestrahlungsgerät gibt daher ein schmaleres Band ohne Frequenzschwankungen aus als Magnetrongeräte.

MW-Bestrahlungsgeräte. (a) MW-Bestrahlungsgeräte, die in dieser Studie verwendet wurden. (b) Änderung der Lösungstemperatur bei Änderung der Ausgangsleistung der MW-Bestrahlungsausrüstung.

Anschließend analysierten wir die E-Feldstärke der MW-Bestrahlungsausrüstung und überprüften die Polarisationsrichtung an der mit MW bestrahlten Probe. Allerdings ist die von diesem kleinen MW-Bestrahlungsgerät erzeugte E-Feldstärkeverteilung über einen weiten Bereich nicht gleichmäßig. Folglich erfordert das E-Feld-Messgerät eine räumliche Auflösung der E-Feldstärke, -Frequenz und -Polarisationsrichtung in und um das Mikroröhrchen, das die Testprobenlösung enthält, und die räumliche Auflösung sollte kleiner oder gleich der Größe von sein die Mikroröhre. Daher verwendeten wir als E-Feld-Messgerät einen optischen E-Feld-Sensor mit einem optischen Wellenleiter, der auf einem kleinen Pockels-Element gebildet wurde, und einer winzigen Dipolantenne, die aus gegenüberliegenden dreieckigen Metalldünnfilmen mit einer Basis von 1,5 mm × 1,2 mm Höhe gebildet wurde mm. Die optischen Eigenschaften des Elements werden durch das von der Antenne empfangene E-Feld verändert (elektrooptischer Effekt). Das E-Feld, das durch den Durchgang eines Laserstrahls durch den optischen Wellenleiter erzeugt wird, moduliert den Laserstrahl direkt optisch, der dann durch die optische Faser läuft. Dies ermöglicht die Messung der E-Feldstärke, -Frequenz und -Polarisationsrichtung, ohne durch die MWs gestört zu werden, die das Messsignal abstrahlen. Die Polarisationsrichtung verlief vertikal zu einer Hauptachse der Antenne des MW-Bestrahlungssystems. Darüber hinaus gibt dieses MW-Bestrahlungsgerät ein deutlich schmales Band ohne Frequenzschwankungen aus (Abb. S2a). Diese Ergebnisse legen nahe, dass dieses MW-Bestrahlungsgerät eine E-Feldstärke mit einer exakten Frequenz von 2,45 GHz und linearer Polarisation erzeugen kann, was eine detaillierte Analyse der Beziehung zwischen MWs und dem Verhalten von an der Biomineralisierung beteiligten Biomolekülen ermöglicht.

Als nächstes haben wir die Temperatur der Probenlösung unter MW-Bestrahlung mit einem Thermoelement-Thermometer gemessen, da MWs die Probe lokal erwärmen. Die Durchschnittstemperatur und die Maximaltemperatur stiegen allmählich mit der Wattleistung des MW-Bestrahlungsgeräts an (Abb. 2b, S2b). Die durchschnittliche Temperatur an der Probenlösung nach MW-Bestrahlung bei einer maximalen Ausgangsleistung (60 W) betrug 37,2 °C und die maximale Temperatur betrug 41,1 °C.

Die unter MW-Bestrahlung und Nichtbestrahlungsbedingungen bei einer Peptidkonzentration von 100 µM gebildeten CaCO3-Niederschläge wurden durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet. AFM-Bilder zeigten, dass mit S-Peptid mineralisiertes CaCO3 ohne Bestrahlung (MW-Nichtbestrahlung) bei 37 °C meist kugelförmige Niederschläge bildet (Abb. 3a, S3e) und unter MW-Bestrahlung fadenförmige Niederschläge bildet (Abb. 3b, S3a). Wir haben auch überprüft, dass CaCO3 ohne Peptide kaum ausgefällt zu werden scheint (Abb. S3i). TEM-Bilder zeigten die Bildung von fadenförmigen Niederschlägen unter MW-Bestrahlung (Abb. S3j) und die Bildung von partikulären Niederschlägen unter MW-Nichtbestrahlungsbedingungen bei 37 ° C, 60 ° C und 90 ° C (Abb. S3k – m). , was fast den AFM-Bildern entsprach. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die CaCO3-Ausfällung unter MW-Bestrahlung durch einen anderen Fällungsmechanismus erfolgt als unter MW-Nichtbestrahlungsbedingungen. Experimente wurden mit Peptidsequenzen durchgeführt, von denen bekannt ist, dass sie eine höhere Fällungsfähigkeit aufweisen als S-Peptid (Abb. S1). Im Gegensatz dazu zeigten die Ergebnisse kaum die Bildung fadenförmiger CaCO3-Niederschläge unter MW-Bestrahlung mit pS-Peptid, Ac-S-Peptid und Ac-pS-Peptid (Abb. S3b–d) oder unter MW-Nichtbestrahlungsbedingungen bei 37 °C (Abb. S3f–h). Daher verringerten wir schrittweise die Konzentration jedes Peptids und beobachteten die Morphologie der CaCO3-Niederschläge unter MW-Bestrahlung. Bei einer Peptidkonzentration von 10 µM führten sowohl das S-Peptid als auch das pS-Peptid unter MW-Bestrahlungsbedingungen zu fadenförmigen Niederschlägen (Abb. S4a, b), während bei Verwendung der anderen Peptide unter MW-Bestrahlung überwiegend kugelförmige Niederschläge beobachtet wurden (Abb. S4c, D). Alle Peptidbedingungen führten bei Nichtbestrahlung mit MW kaum zu fadenförmigen Niederschlägen (Abb. S4e – h). S-Peptid verursachte bei 1 µM aufgrund seiner geringen Fällungsfähigkeit keine CaCO3-Ausfällung, bei allen anderen Peptiden konnten jedoch unter MW-Bestrahlungsbedingungen fadenförmige Ausfällungen beobachtet werden (Abb. S5a–d). Partikelniederschläge wurden meist bei Raumtemperatur oder beim Erhitzen ohne MW-Bestrahlung beobachtet (Abb. S5e – h). Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich bei Peptiden mit geringer Fällungsfähigkeit bereits bei 100 μM fadenförmige Niederschläge bilden können, während sich bei Peptiden mit hoher Fällungsfähigkeit möglicherweise nur bei 1 μM fadenförmige Niederschläge bilden (Tabelle 1).

Veränderung der Morphologie bei MW-Bestrahlung. (a) AFM-Bild von CaCO3-Niederschlägen unter Verwendung von 100 μM S-Peptid bei 37 °C unter Nicht-MW-Bestrahlung (repräsentativ für das Partikelbild). (b) AFM-Bild von CaCO3-Niederschlägen unter Verwendung von 100 μM S-Peptid unter MW-Bestrahlung bei 60 W (repräsentativ für das String-Bild). (c) ζ-Potenziale der Proben nach CaCO3-Mineralisierung unter Verwendung von 10 μM Peptiden unter MW-Bestrahlung und Nichtbestrahlungsbedingungen.

Als nächstes wurde das Oberflächenpotential von CaCO3, das unter MW-Bestrahlung und Nichtbestrahlungsbedingungen unter Verwendung von 10 µM Peptid gebildet wurde, durch ζ-Potenzialmessungen bestimmt. Die ζ-Potenzialwerte waren für alle Peptide unter MW-Nichtbestrahlungsbedingungen negativ (Abb. 3c). Im Gegensatz dazu waren unter MW-Bestrahlungsbedingungen die ζ-Potenzialwerte unter Bedingungen positiv, die zu fadenförmigen Niederschlägen führten (S-Peptid und pS-Peptid), und die ζ-Potentialwerte waren unter Bedingungen, die zu kugelförmigen Niederschlägen führten (Ac-S-Peptid), negativ und Ac-pS-Peptid) (Abb. 3c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Peptide an der Oberfläche der kugelförmigen Niederschläge und Kalzium an der Oberfläche der fadenförmigen Niederschläge hafteten, da diese Peptide negativ geladen waren und Kalziumionen (Ca2+) positiv geladen waren.

Anschließend verringerten wir schrittweise die für die MW-Bestrahlung verwendete Ausgangsleistung (60, 20, 10 und 0 W) und bestätigten die Morphologien und ζ-Potenziale der CaCO3-Niederschläge unter Verwendung von 10 µM pS-Peptid. Das AFM-Bild bei 60 W zeigte nur fadenförmige Niederschläge (Abb. 4a, S4b, S6g), während das bei 20 W eine Mischung aus fadenförmigen Niederschlägen und kugelförmigen Partikeln zeigte (Abb. 4b, S6h). Die AFM-Bilder bei 0 und 10 W zeigten kugelförmige Partikel (Abb. 4c, d, S3f, S6i, j). Die ζ-Potenzialwerte nahmen mit abnehmender Ausgangsleistung allmählich von positiv auf negativ ab, und die Proben mit stärker partikelähnlichen Niederschlägen zeigten negativere ζ-Potentiale. Dies stimmte mit den obigen Ergebnissen überein, die von den 10 µM-Peptiden abgeleitet wurden (Abb. 3c, S4).

Änderung der Morphologie mit der Ausgangsleistung. (a) 10 µM pS-Peptid (60 W). (b) 10 µM pS-Peptid (20 W). (c) 10 µM pS-Peptid (10 W). (d) 10 µM pS-Peptid (0 W). (e) ζ-Potenzial der Proben nach der CaCO3-Mineralisierung bei verschiedenen Ausgangsleistungen.

Im Fall von Peptiden, deren Fällungsfähigkeit relativ hoch war, wurde 1 µM als Peptidkonzentration für die ζ-Potenzialanalyse ausgewählt (wodurch die für die MW-Bestrahlung verwendete Ausgangsleistung (60, 20, 10 und 0 W) verringert wurde). Die ζ-Potenzialwerte nahmen mit abnehmender Ausgangsleistung allmählich von positiv auf negativ ab (Abb. S6a, b), ähnlich wie bei der 10 µM pS-Peptidanalyse (Abb. 4e). Im Falle von Peptiden, deren Fällungsfähigkeit relativ gering war, wurde 100 µM als Peptidkonzentration für die ζ-Potenzialanalyse ausgewählt (wodurch die für die MW-Bestrahlung verwendete Ausgangsleistung (60, 20, 10 und 0 W) verringert wurde). Die ζ-Potenzialwerte sanken allmählich von positiv auf negativ, während die Ausgangsleistung ähnlich wie bei der anderen Peptidanalyse abnahm (Abb. S6c). Als die MW-Leistung verringert wurde, bestätigten wir durch AFM auch, dass sich die Morphologie von Strang zu Partikel für 1 µM Ac-S-Peptid, 1 µM Ac-pS-Peptid und 100 µM S-Peptid änderte (Abb. S6d – f). Diese Ergebnisse implizierten, dass Peptide mit geringerer Mineralisierungsfähigkeit und/oder einer geringeren Peptidkonzentration das Ergebnis der MW-Bestrahlung beeinflussten (fadenförmige Morphologie und positives ζ-Potenzial) und dass eine stärkere MW-Leistung die Mineralisierung beeinflusste.

Wir haben versucht, die Verbrauchsraten der Peptide (das Verhältnis der Menge jedes an die CaCO3-Ablagerungen gebundenen oder darin eingeschlossenen Peptids zur ursprünglichen Peptidmenge) abzuschätzen, indem wir Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) verwendeten, um die Menge des folgenden restlichen Peptids zu bestimmen Niederschlag (Abb. 5a). Die Verbrauchsraten aller Peptide blieben unter MW-Bestrahlung und MW-Nichtbestrahlungsbedingungen bei 37 °C unverändert, wohingegen die Verbrauchsraten aller Peptide unter MW-Nichtbestrahlungsbedingungen bei 60 °C im Vergleich zu denen unter MW-Nichtbestrahlungsbedingungen anstiegen Bedingungen bei 37 °C. Diese Ergebnisse legen nahe, dass MWs eine geringere Wirkung auf Peptide haben.

Auswirkungen von MW auf Ca2+ und die Peptide unter Mineralisierung. (a) Peptidverbrauch, bestimmt aus den Peakflächen nach HPLC-Analysen. (b) Die Menge an Ca2+, die für die Ausfällung in verschiedenen Peptidproben verwendet wurde, bestimmt durch ICP-AES.

Anschließend schätzten wir die Veränderung der CaCO3-Fällungsfähigkeit jedes Peptids unter MW-Bedingungen mithilfe von ICP-AES ab. Wir haben zunächst bestätigt, dass die durch ICP-AES bestimmte Menge an Ca2+, die für die Fällung verwendet wurde (Menge der Niederschläge in der Probe, umgerechnet in Ca2+ Mol), grob mit unserer vorherigen Analyse durch Standardtitration mit Ethylendiamintetraacetat23 unter Nicht-MW-Bestrahlungsbedingungen korrelierte (Abb. 5b, graue Balken). MW-Bestrahlung erhöhte die Menge an Ca2+, die für die Ausfällung unter den Bedingungen (S-Peptid und pS-Peptid) verwendet wurde, was zur Bildung fadenförmiger Niederschläge führte (Abb. 5b, rote Balken). Im Gegensatz dazu veränderte sich die für die Fällung verwendete Menge an Ca2+ unter den Bedingungen (Ac-S-Peptid und Ac-pS-Peptid) nicht, was zur Bildung kugelförmiger Niederschläge führte (Abb. 5b, rote Balken). Darüber hinaus haben wir die relative Permittivität der Ca(HCO3)2-Lösung und jedes Peptids gemessen, um ihre Empfindlichkeit gegenüber MW-Bestrahlung zu bestimmen. Alle Peptide zeigten ähnlich niedrigere relative Permittivitätswerte, wohingegen die relative Permittivität der Ca(HCO3)2-Lösung mindestens viermal höher war als die der Peptide (Abb. S7).

Alle Ergebnisse von HPLC, ICP-AES und Messungen der relativen Permittivität ließen darauf schließen, dass morphologische Veränderungen auf die Wirkung von MWs hauptsächlich auf Ca2+ zurückzuführen sein könnten und dass die Unterschiede in den Auswirkungen von MWs auf Peptide relativ gering waren. Andererseits fiel CaCO3 ohne Peptide nicht aus. Somit beeinflussten Peptide mit geringerer Mineralisierungsfähigkeit und/oder einer geringeren Peptidkonzentration die morphologischen Ergebnisse der MW-Bestrahlung, was der oben beschriebenen ζ-Potenzialanalyse entsprach.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass signifikante MW-Effekte die Morphologie von CaCO3-Niederschlägen verändern, von kugelförmigen Partikeln bis hin zu fadenförmigen Strukturen. Darüber hinaus haben MWs nur einen geringen Einfluss auf die Mineralisierung von CaCO3, wenn die CaCO3-Fällungsfähigkeit eines Peptids hoch ist, wohingegen MWs einen großen Einfluss haben, wenn die Peptid-Fällungsfähigkeit niedrig ist. Diese Studie beleuchtet die Beziehung zwischen mehreren MW-Parametern, wie z. B. der Ausgangsleistung, und mehreren Mineralisierungspeptidparametern, wie z. B. der Niederschlagsmenge. In zukünftigen Studien werden wir mithilfe der Computerchemie die direkte Beziehung zwischen MWs, Peptidsequenzen und Mineralisierung untersuchen25,26 und sie mit nassen experimentellen Ergebnissen vergleichen. Unsere Erkenntnisse können bei der Behandlung von Zähnen und Knochen sowie bei der Entwicklung organisch-anorganischer Nanobiomaterialien hilfreich sein. Darüber hinaus sind die hier beschriebenen Ergebnisse nicht auf die Nanomineralisierung beschränkt, sondern können auf andere molekulare/atomare Reaktionen unter verschiedenen MW-Bedingungen ausgeweitet werden, wie z. B. die Ausgangsleistung zur Änderung der Reaktionsaktivitätsparameter.

Alle Chemikalien und Lösungsmittel waren von Reagenz- oder HPLC-Qualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. HPLC wurde auf einem GL-7400 HPLC-System (GL Sciences, Tokio, Japan) unter Verwendung einer Inertsil ODS-3-Säule (10 × 250 mm; GL Sciences) zur präparativen Reinigung mit linearem Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) durchgeführt. Gradient bei einer Flussrate von 3,0 ml/min. Die Peptide wurden mittels MALDI-TOF-MS auf einem Autoflex III-Massenspektrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA) mit 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure als Matrix analysiert. Die Aminosäureanalyse wurde unter Verwendung einer Inertsil ODS-2-Säule (4,6 × 200 mm; GL Sciences) durchgeführt, nachdem die Proben 24 Stunden lang in einem verschlossenen Röhrchen in 6 M HCl bei 110 °C hydrolysiert und anschließend mit Phenylisothiocyanat markiert wurden.

Die Peptide wurden manuell auf Wang-Harz unter Verwendung der DIPCI (N,N'-Diisopropylcarbodiimid)-DMAP (N,N-Dimethyl-4-aminopyridin)-Methode für den ersten Rest und der Fmoc-Festphasenpeptidsynthese27 mit 2-(1H) synthetisiert -Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU, Watanabe Chemical, Hiroshima, Japan) – 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt, Watanabe Chemical) für die nachfolgenden Reste. Die Fmoc-Entschützung wurde mit 1 % HOBt und 25 % Piperidin in NMP (N-Methylpyrrolidon) durchgeführt. Der Seitenkettenschutz war Ot-Butyl (OtBu) für Asp, Glu und Ser und O-Benzyl (OBzl) für Phosphoserin (pSer). ). Peptide wurden von den Harzen abgespalten und der Seitenkettenschutz wurde durch Inkubation des Peptidharzes für 2 Stunden in TFA (Watanabe Chemical Industries)/H2O/Triisopropylsilan (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) (20:1:1, v/v). Die Peptide wurden durch Zugabe von kaltem Diethylether ausgefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Die Peptide wurden durch RP-HPLC gereinigt und durch Aminosäureanalyse und MALDI-TOF-MS charakterisiert: S-Peptid, m/z 1012,8 ([M + H]+ ber. 1012,8); pS-Peptid, m/z 1092,8 ([M + H]+ ber. 1093,3); Ac-S-Peptid, m/z 1052,4 ([M − H]− ber. 1052,8); Ac-pS-Peptid, m/z 1132,3 ([M − H]− ber. 1132,8). Die Peptide wurden in MilliQ-Wasser auf etwa 1 mM gelöst und die Konzentration wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt. Die Peptidlösungen wurden bei 4 °C gelagert.

Schemata und ein Foto des in dieser Studie verwendeten Mikrowellengeräts sind in Abb. 2a dargestellt. Ein kundenspezifisches Mikrowellengeneratorsystem (MW) vom Halbleitertyp wurde von Minato Medical Science Co., Ltd., Osaka, Japan, hergestellt. Die in dieser Studie verwendete minimale bis maximale Ausgangsleistung betrug 10–60 W (10-W-Schritte); Die Leistung wurde an ein Wechselstromtransformatorsystem ausgegeben. die Schwingungsfrequenz betrug 2450 ± 5 MHz [ein Kompensationswert, gemessener Wert war 2450 ± 3 MHz (Abb. 2a)]; die Antenne war eine Patchantenne (linear polarisierte Welle) VSWR < 1,4; 9–45 % (10–50 W) für das Tastverhältnis. Beachten Sie, dass der Halbleitergenerator über einen koaxialen Hohlleiterkonverter angeschlossen wurde und der aufgetretene MW-Leistungsverlust im Voraus korrigiert wurde. Die MW-Bestrahlung wurde wie folgt durchgeführt: (1) MW-Bestrahlung für 80 Minuten; (2) Entfernen der Wasserschutzabdeckung und 20-minütiges Stehenlassen bei Raumtemperatur; (3) MW-Bestrahlung für 80 Minuten.

Die E-Felder der bestrahlten MWs von den Generatoren wurden mit einem Sensorkopf (6 × 6 × 23 mm, ES-100, Seikoh Giken Co., Ltd., Matsudo, Japan) und einem Controller (C5-D1-A) überwacht , Seikoh Giken Co., Ltd.). Die E-Feldstärke [dBμV/m] wurde mit folgender Berechnung ermittelt:

Ein Thermoelement-Thermometer (Card Logger MR5300, MR9302, CHINO Corp., Tokio, Japan) wurde in ein Mikroröhrchen mit 1 ml MilliQ-Wasser eingeführt und die Temperaturänderung aufgrund der MW-Bestrahlung bei 10–60 W gemessen. Zuvor hatten wir durch die Zeitpunktmessung mittels Thermografie (OPTXI40LTF20CFT090, Optris GmbH, Berlin, Deutschland) überprüft, ob die Temperatur nahezu mit der Thermoelementmessung übereinstimmte.

Vor der CaCO3-Fällung wurde CaCO3 (0,5 mmol) in MilliQ-Wasser (30 ml) suspendiert. CO2-Gas wurde 1 Stunde lang in die gerührte Suspension eingeleitet, dann wurde das verbleibende feste CaCO3 durch Filtration entfernt. Die Ca2+-Konzentration in der Lösung wurde durch Standardtitration mit Ethylendiamintetraacetat22,23 bestimmt. Die CaCO3-Fällung wurde in einem Mikroröhrchen durchgeführt. Die Ca(HCO3)2-Lösung und die Peptidlösung wurden verdünnt und mit MilliQ-Wasser auf die gewünschte Konzentration gemischt und 3 Stunden lang inkubiert. Die MW-Bestrahlung wurde wie folgt durchgeführt: (1) MW-Bestrahlung für 80 Minuten; (2) Entfernen Sie die Wasserschutzabdeckung und lassen Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. (3) MW-Bestrahlung für 80 Minuten. Unter Bedingungen ohne MW-Bestrahlung wurde das Program Temp Control System (PC708, ASTEC, Fukuoka, Japan) zum Erhitzen auf 37 °C, 60 °C und 90 °C verwendet.

Das gesamte Volumen jeder Probe wurde auf frisch gespaltenen Glimmer (1 × 1 cm) gelegt. Nach 5 Minuten wurde das Lösungsmittel mit Filterpapier absorbiert. Dann wurde MilliQ-Wasser (20 µL) auf die Glimmeroberfläche gegeben und sofort mit Filterpapier absorbiert. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, um Salze aus der Probe zu entfernen. Alle Proben wurden vor den AFM-Messungen im Vakuum getrocknet. Tapping-Mode-Bilder wurden mit einem Multimode-Rastersondenmikroskop mit einem Nanscope IIIa-Controller (Veeco, Woodbury, NY, USA) aufgenommen.

Die CaCO3-Fällungsprobe (20 µL) wurde 1 Minute lang auf ein TEM-Gitter gelegt und mit Filterpapier getrocknet. Dann wurde MilliQ-Wasser (20 µL) auf das Gitter gegeben und sofort mit Filterpapier absorbiert. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Alle Proben wurden vor den TEM-Messungen, die bei einer Beschleunigungsspannung von 115 kV durchgeführt wurden (JEM-1400, JEOL, Tokio, Japan), im Vakuum getrocknet.

Die Probenlösung (750 ml für das ζ-Potenzial) wurde zur Messung des ζ-Potenzials in eine gefaltete Kapillarzelle (DTS1070, Malvern Instruments, Worcestershire, UK) überführt. ζ-Potenzialdaten wurden mit einem Zetasizer ZEN3600-Instrument (Sysmex, Kobe, Japan) erfasst, das mit einem 633-nm-Laser ausgestattet war.

Nach der CaCO3-Fällung (10 µM Peptid, 150 µM Ca(HCO3)2) wurden 300 µL MilliQ-Wasser (mit 0,1 % TFA) zu einer 1,2 ml-Probe gegeben. Die 400-µl-Probe wurde mit einem Zentrifugenfilter (Durapore®-PVDF 0,22 µm Ultrafree®-MC-GV, Merck, Tokio, Japan) filtriert. Anschließend wurde eine RP-HPLC-Analyse durch Injektion einer 1-ml-Probe auf ein Inertsil ODS-3 durchgeführt Säule (4,6 × 150 mm; GL Science) und Elution mit einem linearen Acetonitril/0,1 % TFA-Gradienten bei einer Flussrate von 1,0 ml/min.

Nach der CaCO3-Fällung (10 µM Peptid, 150 µM Ca(HCO3)2) wurden 2 ml-Proben mit einem Zentrifugalfilter (Durapore®-PVDF 0,22 µm Ultrafree®-MC-GV) filtriert. Nach der CaCO3-Mineralisierung wurden die Proben mit 5 ml 1 mM CH3COOH und 5 ml HClO4 1 Stunde lang bei 120 °C28 pyrolysiert. Nach der Pyrolyse wurden die Proben mit 1 ml 6 mM HCl und 9 ml MilliQ-Wasser gelöst. Kalibrierungskurven für jedes Element wurden unter Verwendung einer Ca-Standardlösung (für spektrochemische Atomabsorptionsanalyse, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) im Bereich von 0 ppm bis 10 ppm erhalten. Ca wurde bei einer Wellenlänge von 389,785 nm mit einem ICP-AES (Spectroblue® FMX36, Hitachi High-Tech Corporation Tokio, Japan) von Clean Chemical Co. Ltd. nachgewiesen.

10 µM Peptidlösung (1 ml) und 150 µM Ca(HCO3)2-Lösung (1 ml) wurden in das vom Hyogo Prefectural Institute of Technology bereitgestellte Gerät zur relativen Permittivität (SH2-Z, TOYO Corporation, Tokio, Japan) überführt. Daten zur relativen Permittivität wurden bei 0,2 MHz erfasst.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Prof. K. Akamatsu, Dr. T. Tsuruoka, Frau M. Oura, Frau M. Hirata, Herrn K. Iwata (Konan University, Kobe, Japan), Herrn Y. Harada (Clean Chemical Co . Ltd., Suita, Japan), Dr. T. Imai, Herr S. Fujimoto (Ryukoku-Universität, Otsu, Japan), Herr H. Izumi (Hyogo Prefectural Institute of Technology, Kobe, Japan), Herr K. Minaki, Herrn H.Togashi (DSP Research, Inc., Kobe, Japan) und Herrn T. Uraka (Minato Medical Science Co. Ltd., Osaka, Japan) für wertvolle Diskussionen und großzügige Unterstützung. Diese Studie wurde teilweise vom Konan University Research Institute unterstützt.

Die folgenden Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Kenji Usui, Makoto Ozaki und Kan Hirao.

Fakultät für Grenzen innovativer Forschung in Wissenschaft und Technologie (FIRST), Konan-Universität, Kobe, Japan

Kenji Usui, Makoto Ozaki, Kan Hirao, Tsubasa Kosaka, Natsumi Endo, Shuhei Yoshida, Shin-ichiro Yokota und Fumihiro Kayamori

Forschungsinstitut für Nanobio-Umwelt und nichtionisierende Strahlung (RINNIR), Konan-Universität, Kobe, Japan

Kenji Usui, Nobuhiro Nakanishi, Tomohiro Umetani und Fumihiro Kayamori

Beyond5G, gespendete Vorträge, Konan University, Kobe, Japan

Kenji Usui und Nobuhiro Nakanishi

Minato Medical Science Co. Ltd., Osaka, Japan

Yonejiro Arimoto

Seikoh Giken Co. Ltd., Matsudo, Japan

Ryuji Osawa

DSP Research, Inc., Kobe, Japan

Nobuhiro Nakanishi

Abteilung für Materialchemie, Ryukoku-Universität, Otsu, Japan

Kin-ya Tomizaki

Forschungszentrum für innovative Materialien und Verarbeitung, Ryukoku-Universität, Otsu, Japan

Kin-ya Tomizaki

Fakultät für Intelligenz und Informatik, Konan-Universität, Kobe, Japan

Tomohiro Umetani

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TU und KU konzipierten die ursprüngliche Idee und YA, RO, NN und FK bereiteten das MW-Bestrahlungssystem vor und bewerteten es. MO, KH, TK, NE, SY, Si.Y. und KU synthetisierten die Peptide und führten Mineralisierungsexperimente und -messungen durch. MO und KU haben die gesamte Arbeit geschrieben. MO, KH, FK, K.-yT, TU und KU haben die experimentellen Details, Ergebnisse und Diskussion geschrieben. Alle Autoren haben den Aufsatz überprüft. KU, KH und FK überarbeiteten das MS und gingen auf die Kommentare der Gutachter ein.

Korrespondenz mit Kenji Usui oder Fumihiro Kayamori.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Usui, K., Ozaki, M., Hirao, K. et al. Einfluss linear polarisierter Mikrowellen auf die Nanomorphologie der Calciumcarbonatmineralisierung unter Verwendung von Peptiden. Sci Rep 13, 12027 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37473-7

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Eingegangen: 10. März 2023

Angenommen: 22. Juni 2023

Veröffentlicht: 25. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37473-7

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