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Jul 09, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12619 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine Strategie zur Bekämpfung antimikrobieller Resistenzen ist die Entdeckung neuer Antibiotikaklassen. Die meisten Antibiotika interagieren irgendwann mit der Bakterienmembran, um entweder deren Integrität zu beeinträchtigen oder sie zu durchdringen. Zuverlässige und effiziente Werkzeuge zur Bestimmung der Dissoziationskonstante für die Membranbindung (KD) und des Verteilungskoeffizienten zwischen der wässrigen Phase und der Membranphase (KP) sind daher wichtige Werkzeuge zur Entdeckung und Optimierung antimikrobieller Wirkungen. Hier zeigen wir, dass mikroskalige Thermophorese (MST) zur markierungsfreien Messung von KD verwendet werden kann, indem die intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan genutzt wird und dadurch die Notwendigkeit einer Chromophormarkierung entfällt. Als Beweis des Prinzips haben wir die Methode verwendet, um die Bindung einer Reihe kleiner zyklischer AMPs an große unilamellare Vesikel (LUVs) und zwei Arten von Lipid-Nanoscheiben zu messen, die aus Styrol-Maleinsäure (SMA) und quartärem Ammonium-SMA (SMA-QA) zusammengesetzt sind ). Die gemessenen KD-Werte korrelieren gut mit den entsprechenden Messungen mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und spiegeln im Großen und Ganzen auch die minimale Hemmkonzentration (MIC) der getesteten AMPs gegenüber S. aureus und E. coli wider. Wir kommen zu dem Schluss, dass MST eine vielversprechende Methode für den schnellen und kosteneffizienten Nachweis von Peptid-Lipid-Wechselwirkungen oder die Kartierung von Probenbedingungen als Vorbereitung für fortgeschrittenere Studien ist, die auf teure Probenvorbereitung, Markierung und/oder Instrumentenzeit angewiesen sind.

Antimikrobielle Peptide (AMPs) haben als Inspirationsquelle zur Bekämpfung der drohenden antimikrobiellen Resistenzkrise zunehmend Aufmerksamkeit erregt, da die Entdeckung neuer Antibiotikaklassen zum Stillstand gekommen ist1. AMPs sind eine Klasse von Peptiden mit antimikrobieller Aktivität, es ist jedoch auch bekannt, dass sie einige antimykotische und krebshemmende Eigenschaften besitzen2,3. Es handelt sich typischerweise um kurze, kationische Peptide mit etwa 12–50 Aminosäuren, wobei typischerweise mindestens 4 Reste für die Aktivität erforderlich sind4. Sie kommen in den meisten lebenden Organismen vor und sind natürliche und unverzichtbare Bestandteile der angeborenen Immunabwehr5,6,7,8. Derzeit sind mehr als 20.000 Peptidsequenzen mit antimikrobiellen Eigenschaften in speziellen Depots veröffentlicht9,10,11,12,13 und bieten einen Pool potenzieller therapeutischer Kandidaten. Die antimikrobielle Wirkungsweise der meisten AMPs scheint darin zu bestehen, auf die Integrität und/oder das elektrische Potenzial der Membrandoppelschicht abzuzielen oder mehrere Ziele und Kombinationen von Wirkungsweisen zu haben – etwas, das die Entwicklung von Resistenzen erschwert und mit einem einhergeht höhere Fitnesskosten für die Aufrechterhaltung. Mit einigen Ausnahmen steht dies im Gegensatz zu herkömmlichen Antibiotika, die normalerweise ein genau definiertes Ziel haben. Ein zweiter Vorteil von AMPs besteht darin, dass es nicht erforderlich ist, die Membran vollständig zu durchdringen, da membranaktive Peptide ihre Aktivitäten häufig dadurch ausüben, dass sie die Bakterienmembran selbst zerstören, permeabilisieren oder lysieren14,15.

Die AMP-Affinität gegenüber Bakterienmembranen wird häufig auf zwei Arten beschrieben: Als Bindungsereignis, das über die Dissoziationskonstante KD16 beschrieben werden kann; oder als zweiphasiges System, bei dem die AMP-Wechselwirkung mit Lipiden als eine Verteilung zwischen einer Lipidphase und einer wässrigen Phase betrachtet wird, gekennzeichnet durch die Verteilungskonstante KP17. Sowohl KD als auch KP sind daher nützliche Deskriptoren für das Screening von Verbindungen basierend auf ihren Wechselwirkungen mit der Zielbakterienmembran.

Aktuelle Methoden zur Beurteilung der Lipidaffinität weisen typischerweise mehrere Nachteile auf. Sie sind möglicherweise nicht auf stärkere Bindungen anwendbar (NMR)18, erfordern eine Markierung, die sich auf die Bindung auswirkt (Fluoreszenzassays)19, sind zeitaufwändig (NMR und SPR)20,21, erfordern große Probenmengen (NMR) oder erfordern eine Feinabstimmung für jede einzelne Verbindung (SPR und ITC)20,21. Die mikroskalige Thermophorese (MST) ist eine Methode, die diese Nachteile nicht aufweist22. Es handelt sich um ein einfaches, aber leistungsstarkes Werkzeug, das die Bestimmung von Bindungsparametern durch Beobachtung der Auswirkungen der Bindung auf ein Fluorophor und auf die relativen thermophoretischen Eigenschaften der gebildeten Komplexe ermöglicht. Bindungen werden durch Überwachung der zeitlichen Veränderungen der Fluoreszenzintensität eines Komplexes bei Einwirkung eines IR-Lasers erhalten. Der Laser erhitzt eine Reihe von Proben mit unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen, was zu einer Umverteilung der Moleküle entsprechend ihrer relativen Gibbs-Energien in Lösung bei den unterschiedlichen Temperaturen führt (Thermophorese). Änderungen der Fluoreszenz aufgrund von Ligandenbindungseffekten werden beim Erhitzen und erneuten Abkühlen überwacht. Die Methode reagiert empfindlich auf Änderungen der Faltung, Form, Solvathülle, Ladung oder Gesamtgröße des ligandengebundenen Komplexes. Diese Änderungen können sich auf die lokale Umgebung eines Fluorophors auswirken, indem sie die dynamische und statische Löschung sowie die thermophoretischen Eigenschaften des Komplexes verändern und MST empfindlich gegenüber möglicherweise geringfügigen Änderungen der Eigenschaften machen, die sich aus der Bindung ergeben23. MST wird derzeit hauptsächlich zur Beurteilung biomolekularer Wechselwirkungen eingesetzt, einschließlich der Bindung von Liganden an verschiedene Substrate22 und der Polymerisation24. Eine frühere verwandte Anwendung von MST von Yu et al. bewerteten die Bindung eines AMP mithilfe der FITC-Markierung25. MST kann mit Fluorophor-Markierung oder ohne Markierung durchgeführt werden, wobei intrinsisch fluoreszierende Aminosäuren wie W, Y und F genutzt werden. Die nahezu allgegenwärtige Präsenz von W in vielen AMPs bietet die Möglichkeit, die AMP-Bindungseigenschaften direkt durch Nutzung der intrinsischen Fluoreszenz von W zu untersuchen Weitere wichtige Vorteile von MST sind geringe Probenanforderungen, kurze Messzeiten und ein einfacher Versuchsaufbau20,21,26.

Hier zeigen wir, dass MST eine praktikable Methode zur schnellen, markierungsfreien Bestimmung der AMP-Affinität gegenüber Lipiddoppelschichten ist. Wir verwendeten markierungsfreies MST, um fünf zyklische antimikrobielle Hexapeptide (Abb. 1) und ihre Bindungen an drei Lipidsysteme zu untersuchen und verglichen die Ergebnisse mit SPR-Daten zur Bindung an Lipidvesikel.

Strukturen der fünf AMPs. Farben: Rot/Orange – R/K, Blau – W. Großbuchstaben stehen für L-Aminosäuren, Kleinbuchstaben für D-Aminosäuren.

Die AMPs 1–4 wurden auf der Grundlage eines zuvor etablierten Pharmakophors mit abwechselnder und geclusterter Verteilung geladener und hydrophober Einheiten ausgewählt27,28,29,30,31, wobei gezeigt wird, dass die Clusterung von W und geladenen Resten positiv mit der antimikrobiellen Aktivität korreliert4. Es wurde bestätigt, dass die AMPs 1–4 eine antimikrobielle Aktivität haben (Tabelle 1) und eine Kombination aus alternierenden und geclusterten W-Resten mit entweder R- oder K-Resten sind. AMP 5 wurde als Negativkontrolle einbezogen, da es gegenüber den getesteten Bakterienstämmen inaktiv war (Tabelle 1) und eine geringe lipophile Präferenz zeigte.

Die drei verschiedenen Lipidsysteme, die für die Studie ausgewählt wurden, waren große unilamellare Vesikel (LUVs), Styrol-Maleinsäure-Nanoscheiben (SMA)32 und mit quartärem Ammonium funktionalisierte Styrol-Maleinsäure-Nanoscheiben (SMA-QA)33. Die verschiedenen Systeme wurden ausgewählt, um sowohl die Eignung verschiedener Lipidmodelle für die Anwendung von MST und Lipid-AMP-Bindung als auch die Auswirkungen der Wahl des Modellsystems auf die Bindung zu untersuchen. Es wurden SMA-Nanoscheiben und -Vesikel ausgewählt, da sie zuvor in MST23,34 verwendet wurden und die Auswirkungen von Unterschieden in der Oberflächenkrümmung untersucht werden konnten. SMA-QA wurde ausgewählt, da es über einen kationischen Polymergürtel verfügt, im Gegensatz zu SMA, das über einen anionischen Gürtel verfügt.

Da bekannt ist, dass die elektrostatische Anziehung von kationischen AMPs und anionischen Lipiden deren Wechselwirkungen verstärkt, wurde die Assoziation der AMPs sowohl mit reinem DMPC als auch mit einer Mischung aus 95 % DMPC und 5 % PG in jedem der drei Lipidsysteme bewertet. Schließlich wurde SPR als orthogonale Methode verwendet, mit der die von MST abgeleiteten Bindungen verglichen werden konnten.

Die Wechselwirkungen zwischen AMPs 1–5 und LUVs wurden zunächst von SPR als Benchmark für die MST-Messungen untersucht. Die Daten wurden mit denselben Lipidzusammensetzungen erfasst, die auch bei der MST-Datenerfassung verwendet wurden. LUVs wurden auf einem L1-Chip immobilisiert und eine zunehmende Konzentration an AMPs wurde darüber injiziert. Abbildung 2 zeigt typische stationäre Anpassungen der SPR-Messungen. Die nach 180 s extrahierten Dissoziations- und Partitionierungskonstanten KD und KP sind in den Tabellen 3 und 4 aufgeführt. Die Dissoziationsrate koff wurde aus dem Dissoziationsschritt berechnet die von Figueira et al.21 vorgestellte Methodik, zusammengefasst in Tabelle 2.

Verhältnis von RUs (Peptidsignal) und RUL (Lipiddoppelschicht), erhalten aus dem Steady-State unter Verwendung von SPR für (A) 100 % DMPC-LUVs. (B) 95 % DMPC 5 % DMPG LUVs. Das Streudiagramm stellt die experimentellen Werte dar und die durchgezogene Linie stellt die aus Gleichung erhaltene Anpassung dar. (2). Vollständige Sensogramme sind im UiT Open Research Data Depository35 verfügbar.

SPR zeigte Werte für KD, KP und koff im Bereich von 50–800 μM, 1–150 10−3 bzw. 0,2–1,0 s−1. 1 war die stärkste Bindungsverbindung, gefolgt von 3, 2 und 4, wobei inaktives AMP 5 am schwächsten war. Dieser Trend blieb auch bestehen, wenn anionische Lipide vorhanden waren, aber wie erwartet war die Gesamtaffinität aller Verbindungen erhöht. Auch die koff-Werte folgten diesem Trend, wobei das aktivste AMP, 1, die langsamste Dissoziation aufwies. Die Gesamtschlussfolgerung aus der SPR weist auf eine erhöhte Affinität der geclusterten Peptide gegenüber den alternierenden gegenüber sowohl zwitterionischen als auch ionischen Lipiddoppelschichten hin.

Für die KD-Auswertung durch MST wurde FHot während der Phase der temperaturbedingten Intensitätsänderung (TRIC) der MST-Kurve registriert (siehe „Methoden“). Der Vorteil der KD-Bewertung während der TRIC-Phase besteht darin, dass mögliche Auswirkungen einer längeren Erwärmung auf die Thermostabilität der Probe, die die Bindung beeinflussen könnten, vermieden werden können36. Das Dosis-Wirkungs-Profil der MST-Reaktion gegen die Lipidkonzentration für 1–5 folgt weitgehend einer sigmoidalen Kurvenform (Abb. 3A, B). In den Fällen 5 und 4 führte die schwächere Bindung zu einer Verkürzung der Sigmoidkurve, wobei der asymptotische Bereich bei hoher Lipidkonzentration nicht vollständig erfasst wurde.

MST-Reaktion auf die Lipidkonzentration und durchschnittliche KD-Anpassungen von 1–5 in verschiedenen Lipidvesikelzusammensetzungen. Die oberen Felder zeigen 100 nm große Vesikel. (A) 100 % DMPC. (B) 95 % DMPC 5 % DMPG. Die unteren Felder zeigen die leere MST-Antwort. (C) 100 % DMPC. (D) 95 % DMPC/5 % DMPG. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Triplikate dar.

Für jede Lipidzusammensetzung wurde eine Leerserie gesammelt, die nur aus Lipiden bestand, und trotz des Fehlens eines Fluorophors konnte bei den höchsten Lipidkonzentrationen eine schwache MST-Reaktion festgestellt werden. Die Blindreaktion war bis zu Konzentrationen um 1 mM stabil. Die zwei bis drei höchsten gemessenen Lipidkonzentrationen führten jedoch zu einer Hintergrundreaktion oberhalb des Rauschpegels der Grundlinie (Abb. 3C, D), was höchstwahrscheinlich auf die zunehmende Trübung zurückzuführen ist. Die zusätzliche unspezifische Reaktion auf die letzten beiden Datenpunkte stellt somit eine Einschränkung dar, wie schwache Wechselwirkungen zuverlässig gemessen werden können (mM Lipidkonzentrationsbereich). Die Trübung hatte jedoch keinen nennenswerten Einfluss auf die Extraktion von Fnorm in Gegenwart von AMPs (die das Fluorophor tragen), da das viel stärkere Signal des Fluorophors keine Anzeichen dafür zeigte, dass der Trübungsbeitrag zu Fnorm vom Blindprofil übernommen wurde (Rohdaten gezeigt). in Abb. S1). Dies legt nahe, dass die W-Fluoreszenz den dominanten Beitrag zur gemessenen Reaktion leistete, wenn sie vorhanden war. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass bei sehr schwachen Bindemitteln der Lichtstreueffekt die Reaktion dominiert. Peptid 5 zeigt beispielsweise zusammen mit DMPC-Liposomen eine Änderung der Fnorm für die letzten beiden Punkte, dieselben Punkte, die bei der Blindmessung erheblich von Lichtstreuungseffekten beeinflusst werden (Abb. 3A). Der Effekt fehlt jedoch für dasselbe Peptid zusammen mit DMPC:PG-Liposomen, obwohl sich die beiden Blindproben ähnlich verhalten, was zeigt, dass potenzielle Lichtstreuungsbeiträge schwer vorherzusagen oder zu kompensieren sind.

Dass es bei höheren Lipidkonzentrationen zu Lichtstreuung kommt, könnte Bedenken aufkommen lassen, dass die Dichte der Lipide möglicherweise die Thermophorese der Analyten in der Probe behindern könnte, selbst bei nicht interagierenden Spezies. Wie jedoch von Yu et al.25 gezeigt wurde, bleibt die mit FITC nachgewiesene MST-Reaktion nicht interagierender Einheiten bis zu Lipidkonzentrationen von 2,5 mM unbeeinflusst. Darüber hinaus bedeutet die Probenahme der MST-Reaktion in der TRIC-Phase der MST-Spur, dass thermophoretische Effekte weniger dominant sind, wodurch das Risiko von durch die Lipide verursachten Artefakten minimiert wird37.

Die MST-Daten für zwei Nanodisc-Typen, SMA und SMA-QA, wurden mit der gleichen Methodik wie die Vesikeldaten ausgewertet, wobei FHot während des TRIC erfasst und Fnorm gegen log[Lipid] aufgetragen und an Gleichung angepasst wurde. (6). Die Bindungsprofile von AMPs, die an SMA- und SMA-QA-Nanoscheiben binden, zeigen deutlich unterschiedliche Verhaltensweisen (Abb. 4).

MST-Reaktion auf Lipidkonzentration und KD-Anpassungen von 1–5 in verschiedenen Lipid-Nanoscheibenzusammensetzungen. Die linken Felder zeigen SMA-Nanoscheiben und die rechten SMA-QA-Nanoscheiben, bestehend aus (A/E) 100 % DMPC, (B/F) 95 % DMPC/5 % DMPG, (C/G) Polymer (keine Lipide*), und (D/H) nur Nanodisc (kein Peptid). *Äquivalent [Lipid] wird verwendet, um die Menge an SMA abzuschätzen, die bei dieser Lipidkonzentration in den entsprechenden Nanoscheiben vorhanden wäre. Fehlerbalken stellen den Bereich in den Triplikaten dar.

Die SMA-QA-Nanoscheiben erzeugen eine sigmoidale Reaktionskurve (Abb. 4D, E), wie sie für die Vesikel beobachtet wurde, obwohl die Kurve zu höheren Lipidkonzentrationen nach rechts verschoben ist, d. h. AMPs binden schwächer an die SMA-QA Nanoscheiben als zu den entsprechenden Vesikeln. Die Rechtsverschiebung hat zur Folge, dass die Bindungskurven der schwächeren Bindemittel nicht vollständig erfasst werden und in einigen Fällen nur ein minimaler KD bestimmt werden kann. Wie bei Vesikeln kann bei höchsten Lipidkonzentrationen die Lichtstreuung ein Faktor bei der Messung von Fnorm sein. Das Ergebnis ist, dass es unpraktisch wird, die Bindungskurve durch eine weitere Erhöhung der Lipidkonzentration vollständig abzutasten, da ein erhöhter Einfluss von Lichtstreuungseffekten zu erwarten wäre.

Im Gegensatz dazu ist die SMA-Nanodiscs-Reaktion nach links zu niedrigeren Lipidkonzentrationen verschoben, was einer stärkeren Bindung als an die entsprechenden Vesikel entspricht (Abb. 4A, B). Die Kurven weichen auch vom sigmoidalen Fnorm-Profil ab, mit einem sekundären Abfall der Fnorm nach Erreichen des Maximums im mM-Bereich. Solche Profile wurden zuvor bei der MST-Reaktion höherer stöchiometrischer Bindungen beobachtet, bei denen zusätzliche interagierende Liganden zu einer neuen Spezies des Komplexes führten22. Im Fall von Nanodisc-AMP-Wechselwirkungen ist die plausibelste Erklärung, dass direkte Wechselwirkungen zwischen 1–5 und dem SMA-Polymer zu dem atypischen Bindungsprofil führen. In einem Kontrollexperiment ohne vorhandene Lipide kann tatsächlich eine direkte Wechselwirkung zwischen dem freien SMA-Polymer und den AMPs im hohen nM- bis niedrigen µM-Bereich beobachtet werden (Abb. 4C, G). Das Vorhandensein starker Wechselwirkungen mit dem SMA-Polymer und ein mehrphasiges Reaktionsprofil weisen darauf hin, dass die Wechselwirkung mit dem Polymer die Messung in dem Maße dominiert, dass die AMP-Lipid-Wechselwirkung in SMA-Nanoscheiben nicht direkt gemessen werden kann (Tabelle 3). Die Stärke der Wechselwirkung mit dem SMA-Polymer sowie seine Rolle bei der Stabilisierung der Nanoscheibe ließen vermuten, dass das System erheblich gestört werden würde. Daher wurden keine weiteren Versuche unternommen, mehrere Interaktionen aus diesen Antwortkurven zu entfalten.

Die starke Wechselwirkung mit dem SMA-Polymer kann auf den hohen Gehalt an anionischer Maleinsäure (deprotoniert bei pH 7,4) zurückgeführt werden, was zu günstigen elektrostatischen Wechselwirkungen mit den kationischen AMPs führt. Folglich wird keine solche Bindung für das SMA-QA-Polymer beobachtet, das stattdessen reich an kationischen Einheiten ist und daher das attraktive elektrostatische Wechselwirkungspotential für kationische AMPs durch ein abstoßendes Potential ersetzt hat, was sich in einer Verschiebung der Reaktionsprofile zu schwächeren widerspiegelt Bindung.

Ein Vergleich der von MST und SPR abgeleiteten KD für LUVs zeigt, dass die erhaltenen absoluten KD systematisch um einen ungefähren Faktor 4 ausgeglichen werden (Abb. 5C, D und Tabelle 3), aber die relativen Werte innerhalb jedes Datensatzes führen zu derselben Schichtung der Peptide Bindungsstärke an LUVs, gemessen durch MST und SPR. Das inaktive Peptid 5 hatte eine erheblich höhere KD im Vergleich zu 1–4, obwohl das Profil von 5 nicht vollständig erfasst werden konnte. Daher wurde nur die minimale KD bestimmt, was eine Erklärung dafür liefert, warum MST für dieses Peptid nicht die gleiche starke Abhängigkeit von der Lipidzusammensetzung wie SPR feststellte. In Übereinstimmung mit SPR hatten die geclusterten Sequenzpeptide 1 und 3 eine deutlich stärkere Bindung als 4. Dies steht auch im Einklang mit den ermittelten MHKs, wobei 1 und 3 die aktivsten Peptide sind. Diese Beobachtungen stimmen mit früheren Berichten überein, wonach die Häufung von W-Resten positiv mit der antimikrobiellen Aktivität korreliert.

KDs bestimmt durch MST und SPR zu DMPC (hellgrau) und DMPC/PG (dunkelgrau). (A) KD bestimmt unter Verwendung von SMA-Nanoscheiben (weiß: SMA-Polymer), (B) KD bestimmt unter Verwendung von SMA-QA-Nanoscheiben, (C) KD bestimmt unter Verwendung von 100-nm-Vesikeln, (D) KD bestimmt unter Verwendung von SPR und Vesikeln (extrudiert durch 100 nm). Filter). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Triplikate dar.

Der von der SMA-QA abgeleitete KD schneidet in den Fällen, in denen die Kurve ausreichend abgetastet wurde, im Vergleich zu den SPR-Ergebnissen gut ab (Abb. 5B, Tabelle 3). Wenn sich die KD jedoch dem mM-Bereich nähert, wird der SMA-QA-Datensatz nicht ausreichend abgetastet, um zuverlässige Ergebnisse zu liefern. Dies äußert sich am deutlichsten in großen Fehlern, bei denen die angepasste KD empfindlich auf Ausreißer und kleine Abweichungen in der Steigung der Kurve reagiert, da bei den untersuchten Lipidkonzentrationen kein Maximum erreicht wird. Ein Beispiel für eine unzureichende Abtastung und den daraus resultierenden Fehler ist die schlechte Reproduktion der PC/PG-Unterscheidung, die in SPR für 2 beobachtet wurde. Wichtig ist jedoch, dass der KD-Fehler bei ausreichender Abtastung der Kurve mit den vom Benutzer gemeldeten MST-Fehlern übereinstimmt26.

Dies ist jedoch bei den aktiveren AMPs nicht der Fall, bei denen die Bindungsstärke deutlich innerhalb des Probenbereichs liegt. SMA-QA-Nanodiscs eignen sich daher nur zur Beurteilung von AMP-Lipid-Wechselwirkungen, die stärker als der mM-Bereich sind, mittels MST.

Die SMA-Scheiben weisen überschätzte Bindungsstärken auf, was zeigt, dass alle Peptide einen scheinbaren KD von 10 µM oder weniger haben (Tabelle 3) und eine schlechte Unterscheidung zwischen PC- und PC/PG-Lipiden zeigen (Abb. 5A). Die fehlende Unterscheidung wird auf die starke Wechselwirkung mit dem anionischen SMA-Polymer zurückgeführt, die die Reaktion dominiert und die erwartete Bindungsverstärkung durch die Zugabe der anionischen Lipide maskiert.

Im Allgemeinen führt das Vorhandensein von PG-Lipiden zu einer Verringerung der KD für alle Peptide um etwa den Faktor 2, wenn die sigmoidale Bindungskurve vollständig erfasst werden konnte. In zuvor veröffentlichten Arbeiten fanden Christiaens et al.38 heraus, dass einzelne Peptide ein breites Spektrum an Bindungsstärken aufwiesen, von schwachen 350 µM an PC-Vesikel bis hin zu einer stärkeren Bindung im niedrigen µM-nM-Bereich an Vesikel, die reich an anionischen Ladungen sind. Bei der Analyse von MSP-Nanoscheiben mittels ITC und NMR beobachteten Zhang et al.39 eine Bindung an anionische Lipid-Nanoscheiben im Bereich von 1–2 µM. Die durch MST gemessenen KDs stimmen somit mit Ergebnissen in der Literatur überein, die zeigen, dass AMPs in Gegenwart anionischer Lipide im niedrigen µM-Bereich sowohl an Vesikel als auch an Nanoscheiben binden können, wobei eine Abschwächung der Wechselwirkung mit zwitterionischen Membranen zu erwarten ist. Es ist bekannt, dass kationische AMPs eine Selektivität gegenüber Bakterienmembranen aufweisen, bei denen anionische Lipide und LPS auf der Außenmembran vorhanden sind, gegenüber Zellen mit einer neutraleren Oberfläche. Während die für 1–5 beobachtete Verringerung der KD bei Einführung anionischer Lipide nicht so groß ist wie in den obigen Studien beschrieben, ist die in dieser Arbeit eingeführte anionische Komponente (5 %) im Vergleich zu den von Zhang et al. verwendeten 20 % gering . und Christiaens et al.

Der in dieser Arbeit berechnete KD wird mithilfe eines Zwei-Zustands-Modells40 angepasst. Es wird jedoch nicht unbedingt erwartet, dass dies eine genaue Darstellung von Lipid-Wechselwirkungen ist, wenn das Ziel keine definierte Bindungsstelle hat und es möglich ist, dass Selbstaggregation auf der Lipidoberfläche, Sättigungseffekte, kooperative oder kompetitive Bindung auftreten, die Einfluss haben die Bindung weiterer AMPs41,42. Aus diesem Grund ist KD ein nützlicher illustrativer und kommunizierbarer Deskriptor der AMP-Lipid-Bindung, es ist jedoch Vorsicht geboten, den absoluten Wert nicht zu überinterpretieren. Der gemessene scheinbare KD wird am besten als zusammengesetzter Wert betrachtet, der mehrere Prozesse einer komplexen Interaktion darstellt und system- und methodenabhängig ist – wie auch in dieser Arbeit hervorgehoben.

Der Verteilungskoeffizient (KP) beschreibt die Bevorzugung von Verbindungen für Lipid- oder wässrige Phasen, wobei ein hoher KP auf eine größere Bevorzugung der Lipidphase hinweist. Im Gegensatz dazu beschreibt KD den gebundenen Zustand als molekularen Komplex und nicht als Phase. Sowohl KD als auch KP sind nützliche Deskriptoren für AMP-Lipid-Wechselwirkungen, und Instrumente, die beide bestimmen können, können Benutzern ein hohes Maß an Flexibilität bei der Erforschung biophysikalischer Wechselwirkungen bieten. Um die Möglichkeit zu untersuchen, den KP der AMPs 1–5 mithilfe von MST zu bestimmen, wurden die vom MST-Instrument gemessenen Einzelwellenfluoreszenzintensitäten verwendet. Diese Daten werden routinemäßig während der MST-Messungen in der Anfangsphase der MST-Spur zur Verwendung als FCold-Messung erfasst und als „anfängliche Fluoreszenz“ angegeben. Somit ist keine zusätzliche Aufnahmezeit erforderlich. Nach unserem besten Wissen ist dies der erste Versuch, diese Daten zur Bestimmung des KP mithilfe von MST-Hardware zu nutzen. KP wurde extrahiert, indem die Daten an eine durch Gleichung beschriebene hyperbolische Verteilungskurve angepasst wurden. (8), nach Entfernung nicht-hyperbolischer Punkte43.

Es wurden reine Lipid-Blindproben gesammelt, um den Einfluss der Trübung auf die Messungen zu beurteilen (Abb. 6). Für die Vesikel ist dies ein bescheidenes Signal, das im mM-Lipidkonzentrationsbereich linear ansteigt. Der Anstieg steht im Einklang mit der oben berichteten beobachteten MST-Reaktion (Abb. 3C, D), die auf Lichtstreuungseffekte zurückzuführen ist. Beide Arten von SMA-Nanoscheiben folgen ebenfalls einem überwiegend linearen Trend, die Signale sind jedoch intensiver (Abb. 6).

Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten der leeren Lipidproben umfassen nur SMA- und SMA-QA-Nanoscheiben und Vesikel.

Die Hintergrundfluoreszenz für die Vesikel ist bei den Anfangskonzentrationen im Vergleich zu den gemessenen Fluoreszenzintensitäten des AMP mäßig und weist nicht das gleiche Profil auf, wenn die Lipidkonzentration erhöht wird (Abb. S2). Bei den höchsten Lipidkonzentrationen ist ein größerer Anstieg zu beobachten, was den Einfluss der Trübung des Systems zeigt (Abb. 6). Das anfängliche Hintergrundfluoreszenzsignal der SMA-QA-Nanodiscs ist deutlich stärker, und über den gemessenen Konzentrationsbereich bleibt ein erhebliches Niveau erhalten. Wie bei den Vesikeln und SMA-Nanoscheiben stimmt das Intensitätsprofil der SMA-QA-Probe mit vorhandenem AMP nicht mit dem Profil überein, wenn AMP vorhanden ist (Abb. S2). Aus diesem Grund ist es nicht möglich, die leere Basislinie vom AMP-Signal zu subtrahieren. Daher sind die letzten Punkte aufgrund möglicher, aber inkonsistenter Lichtstreuungsbeiträge mit erhöhter Unsicherheit behaftet (Abb. 7 und Abb. S3).

Anfängliche Fluoreszenz- und KP-Anpassungen von 1–5 in verschiedenen Lipidzusammensetzungen von LUVs. (A) 100 % DMPC. (B) 95 % DMPC mit 5 % DMPG. Linien und gefüllte Kreise geben die Passform und die verwendeten Punkte an, ungefüllte Kreise sind nicht enthaltene Punkte. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Triplikate dar.

Viele AMPs, insbesondere bei Verwendung von Vesikeln, zeigten bei niedrigen Lipidkonzentrationen (bei hohem Peptid:Lipid-Verhältnis) einen Anstieg der Fluoreszenz. Dieses Phänomen wurde zuvor von Melo und Castanho beschrieben44, wo sie die Abweichung auf die Sättigung der Doppelschicht mit AMP zurückführen, die die Aufnahme zusätzlicher AMPs verhindert. Es wurde auch auf Änderungen der Konformation und der Peptid-Peptid-Wechselwirkungen innerhalb der Doppelschicht zurückgeführt, wenn diese mit AMPs gesättigt ist45. Um KP dort zu extrahieren, wo Abweichungen beobachtet werden, werden die abweichenden Punkte von der Anpassung ausgeschlossen. Bei niedrigeren Lipidkonzentrationen (hohes Peptid:Lipid-Verhältnis) wird ein kritischer Punkt erreicht, an dem das hyperbolische Modell nicht mehr befolgt wird und Punkte jenseits des kritischen Punktes nicht durch Gleichung beschrieben werden können. (8). Es ist zu beachten, dass das Entfernen von Punkten Unsicherheit mit sich bringt und den Fehler bei der Extraktion von KP erhöht. Dies ist besonders problematisch, da die hyperbolische Form am besten durch die Anfangspunkte entlang der Kurve beschrieben wird, diese aber auch die Punkte sind, die am stärksten von den hohen Peptid-Lipid-Verhältnissen betroffen sind43,44. Sowohl bei SMA-QA als auch bei LUVs wichen viele Punkte von der hyperbolischen Form ab und eine große Anzahl von Punkten musste entfernt werden, so dass normalerweise die letzten 4–5 Punkte für die endgültige Anpassung übrig blieben.

Kurz gesagt folgt der durch SPR bestimmte KP dem KD-Trend, der für beide Lipidzusammensetzungen 1 > 3 > 2 > 4 > 5 ist, wobei der KP im Bereich von 0,3–7 × 103 für DMPC und 0,4–13 × 103 für DMPC/PG bestimmt wurde . Die vom MST abgeleiteten KP stimmen dagegen nicht mit den SPR-Ergebnissen und dem vom MST abgeleiteten KD überein, einschließlich der erwarteten Unterschiede bei der Aufteilung in DMPC und DMPC/PG (Tabelle 4 und Abb. 8). Die Schwierigkeiten bei der MST-KP-Extraktion im Vergleich zur SPR liegen wahrscheinlich in den wesentlichen Unterschieden in den Methoden. Markierungsfreie MST basiert auf der intrinsischen Fluoreszenz von W und das Instrument misst die Intensität bei einer festen Wellenlänge. Die Fluoreszenzintensität von W wird durch statisches und dynamisches Löschen beeinflusst und kann zu Blauverschiebungen führen, also Prozessen, die sich je nach Umgebung, Bindungsart und Tendenz zur Selbstaggregation deutlich unterscheiden46. Erhebliche Blauverschiebungen der W-Emission verschieben das Signalmaximum in unterschiedlichem Ausmaß von der statischen Erkennungsfrequenz, was dazu führt, dass eine geringere Signalintensität erkannt wird. Somit gibt es neben der Phasenverteilung noch weitere Faktoren, die das detektierte Signal negativ beeinflussen können.

KPs ermittelt durch MST mit DMPC (hellgrau) und DMPC/PG (dunkelgrau) im Vergleich zu SPR. Ein KP, bestimmt mit MST- und SMA-Nanoscheiben. B KP bestimmt mit MST und SMA-QA-Nanoscheiben. C KP bestimmt mittels MST und 100-nm-Vesikeln. D KP bestimmt mittels SPR und 100-nm-Vesikeln. Fehlerbalken entsprechen dem Wertebereich für die dreifachen Anpassungen.

Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass die untersuchte MST-Methode zur Extraktion von KP für unser AMP-Panel unzuverlässig war und dass bei der Interpretation der erhaltenen Ergebnisse Vorsicht geboten ist. Es gibt jedoch einige Korrelationen, die darauf hindeuten, dass MST mit einigen weiteren Arbeiten, insbesondere zur Linderung einiger Probleme im Zusammenhang mit der Blauverschiebung, in Zukunft zu einem brauchbaren Werkzeug zur Schätzung von KP werden könnte. Die in neueren Nanotemper-Geräten eingesetzte Spektralverschiebungstechnologie könnte ideal sein, um die KP-Extraktion durch MST47 weiter zu untersuchen.

Die von SMA-QA und Vesikel abgeleitete KD zeigte Unterschiede zwischen den beiden Lipidsystemen. Die erzeugten Vesikel hatten einen Durchmesser von ~ 140 nm und sollten daher aus etwa 200.000 Lipiden (mit einem Molekulargewicht von ~ 140 MDa) bestehen. Im Vergleich dazu enthalten die 22-nm-DMPG-SMA-QA-Nanoscheiben etwa 1300 Lipide (Lipidgewicht von ~ 760 kDa), aber auch einen erheblichen Anteil an Polymer (Tabelle 5). Die verwendeten AMPs haben Molekulargewichte zwischen 884 und 1027 Da. Wenn also mehrere AMPs an eine einzelne Scheibe binden, ist die relative Änderung von Gewicht, Größe und Form des Nanoscheibenkomplexes anders als bei einem Vesikelkomplex, also relativ Änderungen können sich auf die Fnorm-Messung auswirken, da MST empfindlich auf diese Eigenschaften der gemessenen Komplexe reagiert48. Darüber hinaus unterscheiden sich die Anteile der Lipide in den Modellen, die für die AMPs zugänglich sind. In Nanoscheiben sind beide Seiten der Doppelschicht zugänglich und ermöglichen möglicherweise kooperative Wechselwirkungen von gegenüberliegenden Seiten der Scheiben. Im Gegensatz dazu ist bei Vesikeln zunächst nur das äußere Blättchen der Vesikeloberfläche zugänglich, während das innere Blättchen für AMPs nur zugänglich ist, wenn es zunächst durch die Doppelschicht wandert. Da es sich bei MST jedoch um eine Steady-State-Messung handelt, ist unklar, ob sich dies auf die beobachteten Werte auswirkt.

Ein weiterer Unterschied zwischen Vesikeln und Nanoscheiben ist neben der Größe die Planarität der Lipidoberflächen. Als LUVs gelöst, weisen Vesikel eine leicht konvexe Oberflächenkrümmung auf, die zu Oberflächenspannungen führt49. Nanoscheiben hingegen haben eine planare Oberfläche50 – wie die Oberfläche der Zellwand, die auf lokaler Ebene planar ist. In diesem Zusammenhang könnten Nanoscheiben ein repräsentativeres Modellsystem sein. Der Unterschied in der Krümmung der beiden Systeme kann zu den unterschiedlichen Bindungen beitragen, die gegenüber den LUVs und SMA-QA-Nanoscheiben beobachtet werden. Peptide haben aufgrund ihrer bevorzugten Bindung an Packungsdefekte, die durch die Krümmungsspannung entstehen, krümmungsempfindliche Eigenschaften gezeigt. Die Krümmungserkennung wird durch hydrophobe Motive in Peptiden erleichtert und kann die Bindung von Peptiden an stärker gekrümmte Membranen erheblich verbessern51,52,53. Die Bedeutung hydrophober Motive für Peptide wird auch durch die Korrelation der Clusterbildung von W-Resten mit der antimikrobiellen Aktivität charakterisiert. Tatsächlich können solche Effekte im Unterschied der gemessenen KDs von 1–4 zwischen den planaren Lipidbedingungen (SPR und SMA-QA) und den gekrümmten Lipidspezies (LUVs) beobachtet werden: Die geclusterten Reste 1 und 3 weisen eine zehnfache Verbesserung der Bindung auf zu LUVs im Vergleich zu den alternierenden Rückständen 2 und 4, die nur eine vierfache Verbesserung zeigten.

Der Krümmungsunterschied zwischen den beiden Systemen kann sich auf die Lipidphase in den Doppelschichten der Nanoscheiben und Vesikel auswirken. Die als Vesikel solubilisierten Lipide haben eine einheitliche Phase (bei 25 °C liegt diese nahe der Tm von DMPC und in der flüssigen geordneten Phase)54. Im Gegensatz dazu sind die Lipide in SMA-Nanoscheiben weniger dicht gepackt als solche, die als Vesikel gelöst sind, und haben einen niedrigeren Schmelzpunkt55, und die gleichen Eigenschaften werden von den SMA-QA-Nanoscheiben erwartet. Die zentralen Lipide von Nanoscheiben befinden sich in einer geordneteren Phase50, während die äußersten Lipide, die dem SMA-Gürtel am nächsten liegen, durch die Styrolgruppen von SMA55 gestört werden. Es ist bekannt, dass AMPs Lipide bevorzugen, die sich in einer ungeordneteren Phase befinden, und daher würde man heterogene Wechselwirkungen und Verteilungen innerhalb der Nanoscheiben erwarten56.

Zusätzlich zu den Lipiden ist es interessant, die Rolle und den Einfluss der Nettoladung der jeweiligen Gürtelpolymere im Hinblick auf die beiden Nanoscheibensysteme zu berücksichtigen. Es wurde gezeigt, dass einige Peptide Lipide in anionische, lipidreiche Domänen entmischen57. Bei der Bildung solcher Domänen kann die Unordnung an den Domänengrenzen ausgenutzt werden58. Es ist bekannt, dass die Polymerladung die Rekonstitution von Proteinen und Lipidspezies in Nanoscheiben beeinflusst59,60 und daher wird erwartet, dass sie die radiale Verteilung sowohl des anionischen DMPG als auch der untersuchten kationischen Peptide beeinflusst. Das negativ geladene SMA interagiert durch elektrostatische Wechselwirkungen günstig mit den kationischen AMPs und hält dadurch das Peptid auch in der Nähe der ungeordneten Lipidregion. Der unerwünschte Effekt elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen SMA-Polymeren und entgegengesetzt geladenen Spezies wurde zuvor von Ravula et al.59 berichtet, wo Protein-Nanoscheiben-Aggregate aufgrund starker elektrostatischer und hydrophober Wechselwirkungen mit dem Polymer berichtet wurden. In MST wurde dies als starke Bindung der AMPs sowohl an die SMA-Nanoscheiben als auch an das Polymer allein beobachtet, eine Bildung von Nanoscheiben-Aggregaten war jedoch nicht erkennbar. Im Gegensatz dazu kann die kationische SMA-QA eine abstoßende Wirkung auf die AMPs haben und möglicherweise die AMPs aus Teilen der am stärksten ungeordneten Region in der Nähe des Polymers abstoßen, die die günstigsten Wechselwirkungen auf der Nanoscheibe aufweisen (Abb. 9). In ähnlicher Weise stellten Ravula et al.59 die positive Wirkung abstoßender Ladungen auf die Rekonstitution von Membranproteinen fest.

Visualisierung der Unterschiede in Form und Eigenschaften der Lipidmodelle und wie sich diese auf die Wechselwirkungen antimikrobieller Peptide auswirken.

Die kationische Polymerladung könnte beispielsweise auch dazu beigetragen haben, dass SMA-QA-DMPG im Vergleich zu den SMA-QA-DMPC- und SMA-Nanoscheiben größere und heterogenere Nanoscheiben bildete (Tabelle 5). Die Polymerladung könnte auch den endgültigen Lipidgehalt der Nanoscheiben beeinflusst haben. Mittels 31P-NMR wurde geschätzt, dass der DMPG-Gehalt in den SMA- und SMA-QA-Nanoscheiben 2,7 bzw. 4,5 % betrug, ausgehend vom anfänglichen Vesikelgehalt von 5 % (Abb. S4–S7), was einen negativen Effekt auf die Ausbeute für passendes Lipid und SMA zeigt Gebühren.

Der Unterschied in der Größe der beiden Nanoscheibenpräparate kann sich auch auf die Wechselwirkungen auswirken, wobei die größeren SMA-QA-PG-haltigen Scheiben mehr Lipide in einer geordneten Phase aufweisen als die kleineren SMA-Scheiben. Es wird jedoch erwartet, dass die Rolle der Nettoladung des Gürtels der Hauptfaktor für die 20–200-mal stärkere Wechselwirkung zwischen den SMA-Nanoscheiben und kationischen AMPs im Vergleich zu Vesikeln und SMA-QA-Nanoscheiben ist. Während die jeweilige KD der AMPs gegenüber den beiden Systemen eine viel stärkere Bindung an die anionischen SMA-Nanoscheiben zeigte, schien KP überraschenderweise messbar und mit SPR konsistent zu sein. Weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob der vom MST gemessene KP in diesem Fall die tatsächliche Verteilung auf die Lipide in den SMA-Nanoscheiben widerspiegelt oder ob die scheinbare Korrelation ein Produkt von Aufhebungseffekten ist. Dementsprechend ist die Wechselwirkung zwischen den AMPs und dem SMA-QA etwa vier- bis zehnmal schwächer als bei den Vesikeln, was wahrscheinlich auf den Unterschied in der Krümmung und eine elektrostatische Abstoßung zwischen den kationischen AMPs und dem SMA-QA zurückzuführen ist. Dies könnte die Fläche der zugänglichen Lipide verringern, mit denen sie interagieren können, insbesondere die Lipide in der Nähe des Polymers, die sich in einer weniger geordneten Phase befinden.

Die Unterschiede zwischen SPR und MST KD könnten durch die experimentellen Unterschiede zwischen den beiden Methoden erklärt werden. Bei MST wird die Peptidantwort als Funktion der Lipidkonzentration überwacht, während bei SPR die hinzugefügte Peptidmasse zu auf einem Chip immobilisierten Lipiden als Funktion der Peptidkonzentration überwacht wird. Indem die AMP-Konzentration konstant gehalten wird, werden etwaige Aktivitätsänderungen aufgrund konzentrationsabhängiger Prozesse, wie z. B. Selbstaggregation von AMPs, entweder vor oder nach der Bindung, nicht überwacht. Aus dem gleichen Grund sind auch konzentrationsabhängige Prozesse des Lipidsystems wie Fusion, Aggregation oder Trübung Teil des Reaktionsprofils. Trotz dieser Unterschiede erzeugen Vesikel-MST und SPR Bindungsdaten, die hinsichtlich der Rangfolge der AMPs und der relativen Unterschiede zwischen den ermittelten KD-Werten relativ zueinander konsistent sind.

Wir haben gezeigt, dass MST unter Nutzung der intrinsischen Fluoreszenz von W verwendet werden kann, um KD und möglicherweise KP von W-reichen AMPs schnell und markierungsfrei in Modell-Lipiddoppelschichten zu extrahieren. Die gemessene KD von 1–5 korreliert gut mit ihren jeweiligen bakteriziden Aktivitäten (dargestellt durch MIC-Werte) und mit der mit SPR ermittelten Bindungsrangfolge. Wir haben erfolgreich gezeigt, dass MST mit verschiedenen Lipidpartikeln (LUVs und Nanodiscs) verwendet werden kann und sich als robust für die Untersuchung von Membranaktivitäten erwiesen hat. Der negativ geladene Polymergürtel aus SMA-Nanoscheiben ist kein geeignetes Nanoscheibengerüst für Wechselwirkungsstudien mit kationischen AMPs, während SMA-QA-Nanoscheiben in der Lage sind, die von SPR abgeleiteten Ergebnisse der stark bindenden AMPs genau zu reproduzieren. Die Ergebnisse verdeutlichen daher die Notwendigkeit sorgfältiger Überlegungen hinsichtlich des zu verwendenden Lipidsystems und der zu analysierenden Wechselwirkung. Sowohl SMA- als auch SMA-QA-basierte Nanodiscs sind geeignete Konstrukte für Liganden, die nicht direkt mit den Polymeren interagieren.

Die Extraktion der Bindungsparameter schwacher Bindemittel kann aufgrund möglicher Störungen durch Lichtstreueffekte bei hohen Lipidkonzentrationen im Vergleich zu SPR nach dem neuesten Stand der Technik eine Herausforderung darstellen. Andererseits hat die MST-Analyse eine viel schnellere Erfassungszeit und einen geringeren Proben-/Lipidbedarf. Mit der Einführung automatisierter Hardware61 bietet MST eine kostengünstige und zugängliche Alternative mit hohem Durchsatz für die Untersuchung von Ligand-Lipid-Wechselwirkungen, die Assays ergänzt, die störende Eigenschaften der AMP-Membran erkennen, wie zum Beispiel WIND-PVPA, Vesikelleckage oder Patch- Klemmversuche62,63,64.

MST wäre auch eine äußerst geeignete Methode, um kosteneffiziente Scout-Experimente zu Probenbedingungen für Lipid-Wechselwirkungen durchzuführen, bevor fortgeschrittenere Studien begonnen werden, die auf teurer Probenvorbereitung, Kennzeichnung und/oder Instrumentenzeit basieren.

Lipide wurden von Avanti Polar Lipids über Sigma Aldrich (Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland) erworben. MST-Verbrauchsmaterialien von Maricks AS (Oslo, Norwegen). SPR-Verbrauchsmaterialien wurden von Cytiva Europe – Norge (Tyristrand, Norwegen) gekauft. Alle anderen Materialien wurden in analytischer Reinheit von Sigma Aldrich erworben, sofern nicht anders angegeben. Peptide und SMA-QA wurden im eigenen Haus hergestellt.

Die verwendeten Bakterienstämme waren E. coli ATCC 25922 und S. aureus ATCC 9144. Übernachtkulturen und MHK-Tests wurden in kationisch angepasster BD BBL Mueller Hinton II Broth (MHB II, 212322, Becton, Dickson and Company, Sparks, MD, USA) durchgeführt. USA).

2-Chlortritylchloridharz (0,15 mmol, 1,0 meq, 150 mg) wurde 30 Minuten lang in DCM (5 ml) gequollen. Das Harz wurde abgelassen und mit einer Lösung aus Fmoc-Aminosäure (0,3 mmol) und Diisopropylethylamin (1,8 mmol, 313 ml) in DCM (5 ml) behandelt. Die Harzmischung wurde über Nacht unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Harzmischung wurde abgelassen, mit MeOH (3 × 5 ml) behandelt, um nicht reagierte Stellen abzudecken, und mit Diethylether (3 × 5 ml) getrocknet. Die linearen Peptide wurden mit einem automatisierten Festphasen-Peptidsynthesizer (Biotage Initiator + Microwave System with Robot Sixty) hergestellt. Das vorbeladene 2-Chlortritylchloridharz wurde zunächst in DMF gequollen (20 Minuten, 70 °C). Fmoc-Entschützungen umfassten die Behandlung des Harzes mit 20 % Piperidin/DMF (4,5 ml, 3 Min.) einmal bei Raumtemperatur. gefolgt von einer zweiten Behandlung bei 70 °C im Mikrowellenreaktor. Aminosäurekopplungen umfassten die Behandlung des Harzes mit 4 Äq. Fmoc-Aminosäure (0,5 M in DMF), 4 Äq. HOBt (0,5 M in DMF), 4 Äq. HBTU (0,6 M in DMF) und 8 Äq. von DIEA (2 M in NMP) für 5 Minuten bei 75 °C durch einen Mikrowellenreaktor für alle Fmoc-Aminosäuren außer Fmoc-Arg(Pbf)-OH, das 60 Minuten bei Raumtemperatur gekoppelt wurde. Nach jeder Fmoc-Entschützung und Aminosäurekopplung wurde das Harz mit DMF gewaschen (4 × 4,5 ml × 45 s). Nach der Herstellung des harzgebundenen, seitenkettengeschützten linearen Peptids wurde eine abschließende Fmoc-Entschützung und Wäsche durchgeführt und das Harz getrocknet (3 × 5 ml MeOH, 3 × 5 ml Et2O). Das harzgebundene Peptid wurde mit 20 % 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol in DCM (2 × 5 ml × 15 Min.) behandelt, gefolgt vom Spülen des Harzes mit DCM (5 ml). ). Die Filtrate wurden kombiniert und unter reduziertem Druck konzentriert, um das seitenkettengeschützte lineare Peptid zu ergeben.

Das lineare Peptid (ca. 0,15 mmol) und Diisopropylethylamin (0,9 mmol, 157 ml) wurden in DMF (10 ml) gelöst und unter leichtem Rühren zu einer Lösung von PyBOP (0,45 mmol, 234 mg) in DMF (100 ml) gegeben Zimmertemperatur. Nach 1–2 Stunden (die Vollständigkeit wurde durch Massenspektrometrie überwacht) wurde die Mischung durch verminderten Druck konzentriert und mit einer Lösung aus TFA/Triisopropylsilan/Wasser (4 ml, 95 %, 2,5 %, 2,5 %) behandelt und dann stehen gelassen 3 Std. Die Mischung wurde unter einem N2-Gasstrom konzentriert und anschließend mit eiskaltem Diethylether (15 ml) ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Diethylether (15 ml) gewaschen, in 50 % Acetonitril/Wasser gelöst und lyophilisiert, um das rohe, zyklische, seitenkettengeschützte Peptid zu ergeben.

Die Peptide wurden durch präparative Umkehrphasen-HPLC (Waters 600-Gerät mit Waters 2487 Dual Absorbance-Detektor) mit einem SunFire Prep gereinigt. C18-OBD-Säule (10 mm, 19 × 150 mm) unter Verwendung linearer Gradienten von 0,1 % TFA/Wasser (Puffer A) und 0,1 % TFA/Acetonitril (Puffer B) mit einer Flussrate von 10 ml/min, sofern nicht anders angegeben.

Rohe und endgültige zyklische Peptidprodukte wurden mittels FT-MS (Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL-Instrument) und durch analytische Umkehrphasen-HPLC (Waters 2795 Alliance HT-System mit Waters 2996 PDA-Detektor) unter Verwendung einer Ascentis C18-Säule (3 mm, 3 mm) analysiert × 100 mm) und Lösungsmittel 0,1 % TFA/Wasser (Puffer A) und 0,1 % TFA/Acetonitril (Puffer B) mit einem linearen Gradienten von 0–60 % Puffer B über 15 Min. und einer Flussrate von 0,5 ml/Min.

Die MICs für 1–5 wurden anhand der CLSI M07-A9-Richtlinien65 bestimmt. Arbeitslösungen wurden in doppelt destilliertem Wasser mit max. 1 % DMSO. Für jedes Peptid wurde ein Konzentrationsbereich zwischen 256 und 0,25 µg/ml getestet. Das bakterielle Inokulum betrug 1 × 106 Zellen/ml und wurde 1:1 mit jeder Testverbindung in einer Polypropylen-Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen (655209, Greiner Bio-One, Kresmünster, Österreich) inkubiert. Jeder MHK-Test wurde in drei biologischen Replikaten durchgeführt, bestehend aus vier technischen Replikaten. Für jedes technische Replikat wurden Positivkontrollen (ohne Antibiotika) und Negativkontrollen (ohne Bakterien) einbezogen. Zur Sicherstellung der Qualitätskontrolle wurde das Referenzantibiotikum Erythromycin einbezogen. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Der MHK-Wert wurde als die niedrigste Konzentration der Verbindung definiert, die zu keinem sichtbaren Bakterienwachstum führte.

Nach dem Verfahren von Ravula et al.33 wurde (2-Aminoethyl)trimethylammoniumchlorid-Hydrochlorid (9,38 mmol, 1,3 g) zu einer Lösung von Styrol-Maleinsäureanhydrid (SMA, 1 g) in wasserfreiem DMF (5 ml) gegeben, gefolgt von Trimethylamin (56,7 mmol, 5 ml), woraufhin die Mischung eine dunkelgelbe Farbe annahm. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang bei 70 °C gerührt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Diethylether ausgefällt. Der Niederschlag wurde dreimal mit Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Zwischenprodukt wurde in Essigsäureanhydrid (317 mmol, 30 ml) gelöst und mit Natriumacetat (8,05 mmol, 660 mg) und Triethylamin (1,98 mmol, 200 mg) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 12 Stunden lang bei 80 °C gerührt, abgekühlt und in Ether ausgefällt. Der Niederschlag wurde dreimal in Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde dann in Wasser gelöst und durch eine Sephadex LH-20-Säule geleitet. Das Produkt wurde gesammelt und dann lyophilisiert, um ein kristallines braunes Pulver zu ergeben und durch IR-Streckfrequenzverschiebung von 1774 auf 1693 cm−1 bestätigt (Abb. S8).

DMPC- und DMPC:5 % DMPG-Vesikel wurden durch Solubilisierung einer bekannten Menge Lipid in Chloroform mit einer kleinen Menge Methanol hergestellt, um die Auflösung der PG-Lipid-Kopfgruppen zu unterstützen. Die Chloroform-Stammlösung wurde im Vakuum getrocknet, um einen Lipidfilm zu erzeugen, der weitere 3 Stunden lang getrocknet wurde. Der Lipidfilm wurde in 10 mM TRIS-Puffer (pH 7,4), der 100 mM NaCl enthielt, solubilisiert, um eine 20 mM milchige Lipid-Stammlösung zu ergeben.

Um den Vesikel-Arbeitsvorrat herzustellen, wurde 1 ml Vesikelvorrat mit einem Avanti Lipids-Miniextruder 20 Mal durch einen 0,1-µm-Filter extrudiert. Die Vesikelgröße wurde mit einem Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical Ltd, Malvern, Vereinigtes Königreich) bestätigt. Eine 200-µL-Vesikelprobe, gemessen in 40-µL-Mikroküvetten, ergab Vesikeldurchmesser von 144 ± 44 nm (DMPC) und 140 ± 48 nm (DMPC/PG).

Für die Nanodisc-Präparation wurden DMPC und DMPC mit 5 % DMPG 21 mM Vesikelvorräten verwendet. Die Vorräte wurden mit einer 8 %igen SMA-Vorratslösung kombiniert, um eine endgültige SMA-Konzentration von 1 % für SMA-Nanoscheiben zu ergeben. Die Vorräte wurden mit einem 100 mg/ml SMA-QA-Vorrat kombiniert, um ein endgültiges Lipid:SMA-QA-Gewichtsverhältnis von 1:1,5 zu ergeben. Die kombinierte SMA/SMA-QA- und Lipidmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und durch SEC gereinigt. Fraktionen, die SMA/SMA-QA-Scheiben enthielten, wurden unter Verwendung von Zentrifugationsfiltern konzentriert. Die Gesamtlipidkonzentration wurde durch 31P-NMR bestimmt (Abb. S4–S7). Die Nanoscheibengröße wurde mit einem Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical Ltd, Malvern, Vereinigtes Königreich) bestätigt. Eine 200-µL-Nanoscheibenprobe, gemessen in 40-µL-Mikroküvetten, ergab Nanoscheibendurchmesser von 10,1 ± 3,0 nm (SMA DMPC), 9,2 ± 2,9 nm (SMA DMPC/PG), 12,8 ± 4,1 nm (SMA-QA DMPC) und 22,5 ± 11,8 nm (SMA-QA DMPC/PG) (Abb. S9–S11).

Die SPR-Messungen wurden mit einem T200 Biacore-Gerät (GE Healthcare, Oslo, Norwegen) bei Raumtemperatur durchgeführt. Ein L1-Chip wurde mit extrudierten DMPC-Liposomen (1 mM in 10 mM HEPES-Puffer pH 7,4 mit 100 mM NaCl) unter Verwendung einer Flussrate von 2 µL/min für 2400 s bedeckt. Die Chipabdeckung wurde durch 1-minütige Injektion von 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin bei 30 µL/min getestet, wobei eine Änderung von < 400 RU eine ausreichende Abdeckung anzeigt.

Eine steigende Konzentration der getesteten Peptide (Peptide 1, 2, 3 und 4 – von 4 bis 128 µM; Peptid 5 – von 24 bis 768 µM) wurde über immobilisierte Vesikel mit einer Flussrate von 15 µL/min für 200 s mit einem 400 s Dissoziationsphase. Die Liposomenoberfläche wurde nach jeder Injektion durch drei aufeinanderfolgende Injektionen von 10 mM NaOH mit 30 µL/min für jeweils 30 s stabilisiert. Zwischen den Experimenten wurde die Chipoberfläche nacheinander mit 20 mM CHAPS, 40 mM Octyl-β-d-glucopyranosid und 30 % Ethanol gereinigt, wobei jede Lösung 1 Minute lang mit 30 µL/Minute injiziert wurde. Die Kontrollflusszelle wurde identisch behandelt, mit der Ausnahme, dass nur die HEPES-Pufferlösung injiziert wurde. Die Ergebnisse wurden mit hauseigenen MATLAB-Skripten (MATLAB R2020a; Skripte sind verfügbar unter https://github.com/MarJakubec) verarbeitet.

KD wurde aus einer Steady-State-Analyse unter Verwendung der Intensitäten bei der Dissoziationszeit von 190 s unter Verwendung von Gleichung (1) ermittelt. (1):21

Dabei ist Req die Reaktion im stationären Gleichgewicht, c die Peptidkonzentration, Rmax die maximale Reaktion und Roff der Reaktionsversatz.

KP wurde aus denselben Steady-State-Affinitätswerten unter Verwendung der von Figuera et al. vorgestellten Methode, Gl., erhalten. (2):21

Dabei sind RUS und RUL die relativen Reaktionen von gelösten Stoffen (Peptiden) bzw. Lipiden, γL ist das Molvolumen der Lipide, MS und ML sind die Molekülmassen von gelösten Stoffen bzw. Lipiden und [S]W ist die Konzentration von gelösten Stoffen im Wasser. KP und σ werden aus der Anpassung ermittelt (wobei σ das Verhältnis von Lipid zu gelöstem Stoff ist).

Für die Koff-Bewertung haben wir den Formalismus von Figuera et al.21 zur Linearisierung des Dissoziationsprozesses verwendet, wobei wir den Beitrag von zwei verschiedenen Populationen zur Dissoziationsreaktion identifiziert haben. Koff-Werte wurden dann durch Gleichung erhalten. (3) und gemittelt nach Gl. (4):

Dabei ist SL das linearisierte Verhältnis von gelöstem Stoff und Lipid, α und β einzelne Populationen und SL,r der zurückgehaltene Anteil gelöster Stoffe.

Alle MST-Messungen wurden auf einem NanoTemper Monolith NT durchgeführt. Etikettenfreies Instrument mit Monolith NT. Markierungsfreie, standardmäßig behandelte Kapillaren ohne Hintergrund.

Es wurde eine Verdünnungsreihe von Vesikeln/Nanoscheiben mit Lipidkonzentrationen von 3 mM bis 100 nM hergestellt, die 15 einzelne Proben und eine zusätzliche Null-Lipid-Probe umfasste, also insgesamt 16 Lipidkonzentrationen. Die endgültigen MST-Proben wurden als Kombination aus 25 µL Lipidlösung und 25 µL 5 µM Peptidlösung hergestellt (Tabelle S1 in den Hintergrundinformationen).

MST-Messungen wurden mit einer auf 15 % eingestellten Anregungsleistung und einer hohen MST-Leistung durchgeführt. Die Laserzeiteinstellungen waren: 3 s vor dem Laser, 30 s Einschaltzeit und 3 s nach dem Erhitzen. FHot wurde aus der T-Sprung-Periode nach 1,5 s und FCold in der Sekunde vor der IR-Laseraktivierung entnommen. Für die Bewertung von KP wurde die anfängliche Fluoreszenz als der Wert herangezogen, der während des Zeitraums vor der Anwendung des Lasers gemeldet wurde. Die MST-Reaktion und die anfängliche Fluoreszenz wurden direkt als Textdatei zur weiteren Verarbeitung in MATLAB extrahiert.

Die Dissoziationskonstante KD beschreibt das Gleichgewicht zwischen der Konzentration von gebundenem und ungebundenem Liganden40.

In einem typischen Bindungsexperiment, das eine sigmoidale Kurve ergibt, kann die Hill-Gleichung angepasst werden, um KD:66 zu erhalten

Dabei ist y die MST-Reaktion, y0 die MST-Reaktion des AMP in einer wässrigen Lösung (d. h. in Abwesenheit von Lipiden), n der Hill-Koeffizient und EMax die maximale Wirkung des getesteten Substrats66. Die Entfernung abgelegener MST-Reaktionspunkte war notwendig. Fehlerhafte Punkte wurden durch schlechte MST-Spurenformen oder eine höhere als erwartete anfängliche Fluoreszenz identifiziert, die in den anderen Replikaten oder nachfolgenden Punkten fehlte, ansonsten war jedoch keine weitere Datenverarbeitung erforderlich. In allen Fällen wurde die MST-Reaktion gegen die logarithmische Lipidkonzentration in nM aufgetragen und an Gl. angepasst. (6).

Der Verteilungskoeffizient Kp definiert die Präferenz eines gelösten Stoffes für eine wässrige oder lipidische Umgebung, wobei ein größerer Kp eine stärkere Präferenz für die lipidische Umgebung anzeigt.

Der Kp eines Moleküls kann experimentell bestimmt werden, indem Änderungen der Fluoreszenzintensität in Gegenwart einer zunehmenden Lipidkonzentration beobachtet und an Gleichung angepasst werden. (8)43.

In Gl. (8) Die Fluoreszenzintensität des AMP (I) wird auf die Fluoreszenzintensität des AMP in einer wässrigen Umgebung (Iaq) normiert, Vm ist das Molvolumen der Lipide und IL ist die Fluoreszenzintensität des AMP in der Lipidumgebung . Für Vm wird das durchschnittliche Molvolumen der Lipidzusammensetzung verwendet. Im Falle der reinen DMPC-Umgebung wird der Vm von DMPC (1,023 nm3) angenommen, und im DMPC-DMPG-Gemisch ist es der gewichtete Durchschnitt relativ zur verwendeten Zusammensetzung (Vm DMPG = 0,997 nm3)54.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind im UiT Open Research Data Repository https://doi.org/10.18710/XZB5KI verfügbar.

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Dieses Projekt wurde vom DigiBiotics-Projekt (Forschungsrat Norwegens, Projekt-ID 269425), dem AntiBioSpec-Projekt der UiT der Arktischen Universität Norwegens (Cristin ID 20161326) und dem NanoAMP-Projekt (Forschungsrat Norwegens, Projekt-ID 275186) finanziert.

Open-Access-Finanzierung bereitgestellt von UiT The Arctic University of Norway (einschließlich Universitätsklinikum Nordnorwegen).

Fachbereich Chemie, Fakultät für Naturwissenschaften und Technologie, UiT der Arctic University of Norway, 9019, Tromsø, Norwegen

Philip Rainsford, Fredrik G. Rylandsholm, Martin Jakubec, Mitchell Silk, John-Sigurd Svendsen, Richard A. Engh und Johan Isaksson

Forschungsgruppe für Wirts-Mikroben-Interaktionen, Abteilung für Medizinische Biologie, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, UiT der Arctic University of Norway, 9019, Tromsø, Norwegen

Eric Juskewitz und Johanna U. Ericson

Naturstoffe und medizinische Chemie, Abteilung für Pharmazie, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, UiT der Arctic University of Norway, 9037, Tromsø, Norwegen

Johan Isaksson

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Konzeptualisierung: PR Peptidsynthese und -reinigung: MS MIC-Assay: EJ Nanodisc- und Vesikelvorbereitung und MST: PR und FGR Vesikelvorbereitung und SPR: MJ Datenanalyse: PR, MJ und JI Originalentwurf: PR Visualisierung: PR Schreiben und Bearbeiten: PR , MJ, FGR, MS, JI, RE Aufsicht: JI, RE, JSS und JE Alle Autoren haben die endgültige Version überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Johan Isaksson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rainsford, P., Rylandsholm, FG, Jakubec, M. et al. Markierungsfreie Messung antimikrobieller Peptidinteraktionen mit Lipidvesikeln und Nanoscheiben mithilfe mikroskaliger Thermophorese. Sci Rep 13, 12619 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39785-0

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Eingegangen: 02. Mai 2023

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 03. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39785-0

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